基于理性设计提高1,3-丙二醇氧化还原酶的稳定性和活性

1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol oxidoreductase,PDOR)是甘油生物合成1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)的关键限速酶之一。使用PoPMuSiC 2.1计算肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)来源PDOR(KpPDOR)突变的折叠自由能,结合HotSpot Wizard 3.0对催化中心附近氨基酸的功能热点分析和保守残基鉴定,理性选取突变位点,构建定点突变。经诱导表达、蛋白纯化和酶学性质研究,获得催化性能、热稳定性和pH耐受性提高的突变体。V155N突变体在37℃,pH 7.5下的还原活性为KpPDOR的1.7倍,pH 4.0时是KpPDOR的2.5倍。N262E突变体37℃下半衰期为KpPDOR的1.4倍。分析蛋白结构,发现Val155突变为Asn导致新形成两个氢键,稳定了Val155所在的β-折叠结构。而Asn262突变为Glu形所成的两个氢键,可增强催化中心刚性,提升酶稳定性。静息细胞转化甘油合成1,3-PD,发现突变体V155N工程菌株1,3-PD产能为1.16 mmol/L/OD_(600),高于野生型KpPDOR工程菌株的0.82 mmol/L/OD_(600)。此理性设计方法对改良其他工业酶的性能有一定参考价值。

编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达

利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到温控表达载体pHsh,得到重组载体pHsh-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS-PAGE分析显示:融合表达产物的相对分子质量均为43 000,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yqhD的基因工程菌进行表达研究表明:42℃诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到100 IU/mg,而对照菌株的酶活力仅为0.5IU/mg。

编码1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达

采用PCR法克隆了巴氏梭菌 (Clostridiumpasteurianum)CpN 86菌株编码 1 ,3 丙二醇氧化还原酶基因 (dhaT基因 ) ;完成了dhaT基因测序、表达载体构建和在大肠杆菌中表达 ;分离和纯化了dhaT基因表达的重组蛋白。实验结果 :( 1 )PCR法克隆的dhaT基因和肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae菌株dhaT基因的序列同源性为 82 9% ;( 2 )dhaT基因表达蛋白的酶活为 1 0 8U mg ;( 3)dhaT基因表达的蛋白分子量为 43kD ;( 4 )Westernblot确定了dhaT基因表达的蛋白和CpN 86菌株天然蛋白有相同的抗原反应。

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。

克雷伯杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质

在有氧条件下，利用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子离子交换层析和Blue Sepharose CL-6B亲和层析，同时分离并提纯克雷伯杆菌胞内的1，3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶．研究表明，1，3-丙二醇氧化还原酶的纯化倍数为35．86倍，回收率为5．17％，该酶最适表观反应温度为57℃，最适反应pH值为9．5．在30℃及pH-8．0～10．0时，该酶具有良好的稳定性．在45℃和pH-9．5条件下，该酶以1，3-丙二醇和NAD^＋为底物，其米氏常数K。分别为15．8，0．2mmol·L_。．1，3一丙二醇氧化还原酶对生理反应底物3-羟基丙醛活性最大，对其他醇类也有氧化能力．Mn^2＋对酶有显著激活作用，巯基保护剂能明显提高酶的活力．

重组1,3-丙二醇氧化还原酶酶学性质和稳定性的研究

1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是以甘油为底物生产1,3-PD途径中的关键酶之一。将dhaT在E.coliBL21(DE3)pLysS进行了表达,对含有6×His标记的PDOR进行了纯化,同时考察了重组PDOR的酶学性质和稳定性。重组PDOR反应的最适pH和温度分别是10.0和55°C;在pH7.0～8.0,酶保持了较高的稳定性,酶在30°C保温表现出较高的稳定性;Ca2+,Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,而Fe2+,Na+,NH4+和Mn2+对酶活有促进作用;冷冻干燥处理后,PDOR酶活有一定的损失;添加适当浓度的保护剂——海藻糖、葡萄糖、蔗糖、聚乙二醇,对酶在冷冻干燥时有保护作用;添加5%蔗糖的固体酶制剂在保存过程中表现出较好的稳定性。

克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

以基因组DNA为模板,利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中扩增得到含有1,3丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的DNA片段,将其定向连接到克隆质粒pGEM-3zf上,得到重组质粒pGEMdhaT。将此重组质粒转化到受体菌EscherichiacoliDH5α中,通过蓝白斑鉴定挑选出阳性菌株。DNA序列分析表明其基因全长为1185bp。将该片段插入表达载体pSE380,构建成重组子pSE-dhaT,并在E.coliJM109中获得表达,经SDS-PAGE检测,表达产物分子质量与天然纯1,3丙二醇氧化还原酶(DHAT)相同,约为43ku。

1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与原核表达

大肠杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶被yqhD的基因编码,能催化羟基丙醛生成1,3-丙二醇。采用PCR方法从大肠杆菌中扩增到yqhD,测序结果显示该片段大小为1164 bp。将目标片段克隆到原核表达载体pET28(α+)中并转化到大肠杆菌Novablue,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明克隆得到的yqhD基因能在大肠杆菌Novablue-pET28中实现蛋白表达;在25℃条件下,IPTG诱导12 h后,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到124 U/mg,而野生型的酶活力仅为1.4 U/mg;重组菌全细胞发酵结果显示,产物1,3-丙二醇的产率能达到65%,而野生型仅为9.5%。

来源于克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶的同源建模

用Swiss-Model和Modeller对来源于Klebsiella pneumonide的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)进行三级结构建模,并对所得的6个目标模型进行评价和比较,从中选择最好的一个模型,预测了辅酶NADP+和Fe2+在PDOR结构空间的近似位置,并定位了与NADP+和Fe2+作用的相关残基。

甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达

将dhaT基因片段以顺反子的形式插入到重组质粒pMD19TS2中gldABC基因的下游,形成重组克隆质粒pMD19TS3,进而将gldABC与dhaT基因以多顺反子的形式亚克隆至pET-28a(+)表达载体上。终浓度为1mmol/L IPTG诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT 2h,SDS-PAGE电泳分析结果表明分别在甘油脱水酶三个亚基分子量相对应的61ku、21ku、16ku和1,3-丙二醇氧化还原酶亚基分子量相对应的42 ku的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶23.7U/mL,1,3-丙二醇氧化还原酶30.4 U/mL。

丁酸梭杆菌VPI3266甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的克隆、表达

对丁酸梭杆菌VPI 3266的1,3-丙二醇代谢途径关键酶甘油脱水酶（Dha B）与1,3-丙二醇氧化还原酶（Dha T）进行了研究。甘油脱水酶基因dha B全长3315bp,编码两个蛋白亚基,分别为甘油脱水酶的核心酶和脱水酶的再激活酶。前者全长2367bp,编码788个氨基酸,后者全长918bp,编码305个氨基酸。通过构建重组质粒,使其在大肠杆菌中实现了活性表达。1,3-丙二醇氧化还原酶基因dha T全长1166bp,编码388个氨基酸,属于NADP依赖的离子激活的醇脱氢酶家族III。通过IPTG诱导,在大肠杆菌中实现了高效表达,酶活达到5.2U/m L。并通过Ni亲和柱获得了电泳纯的蛋白。蛋白相对分子质量为4.19×104。该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为10.0,在p H值8.5~10.0范围内比较稳定,在45℃保温2h,酶活还残存50%。该酶以1,3-丙二醇为底物,在生理条件下的Vmax和Km分别为29.2U/mg和19.8mmol/L。

1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆与序列分析

以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因dhaT,并将该基因克隆到pMD19-TSimple载体。基因序列分析表明,dhaT基因全长为1158bp,与GenBank上已发表基因序列的同源性达99%,氨基酸同源性为100%。

1,3-丙二醇氧化还原酶结构与功能关系的探讨

用生物信息学方法对来源于klebsiella pneumonide的1,3-丙二醇氧化还原酶(即1,3-丙二醇氧化还原酶,PDOR)进行高级结构模建,并搜索其功能位点,以所得三维结构为对象,定位其铁信号结合位点、辅酶NADP大致位置以及可能的底物结合部位;在此基础上模拟PDOR活性部位,探讨该酶的构效关系。

克雷伯肺炎杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因克隆及表达条件研究

1,3-丙二醇氧化还原酶是甘油歧化为1,3-丙二醇的一种关键酶。本研究从克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组中,用PCR方法克隆了其编码基因dhaT。TA克隆测序正确后,构建胞内表达载体pET-28a-dhaT和分泌表达载体pET-22b-dhaT,然后转化E.coliBL21(DE3)进行原核表达。表达部位确定、SDS-PAGE和酶活分析表明,该酶得到了高水平表达。其中使用pET-22b表达的目的蛋白大都是不溶的包涵体;而使用pET-28a表达的目的蛋白胞内可溶,占胞内可溶总蛋白的45%,占菌体总蛋白的25%。常规(30℃)诱导表达即呈现1,3-丙二醇氧化还原酶活性,但低温(20℃)14 h诱导显示3.7倍的酶活性。

大肠杆菌中1,3-丙二醇氧化还原酶的表达与纯化

目的:在大肠杆菌中表达1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR),并对PDOR进行纯化。方法:从克雷伯氏肺炎杆菌(Kleb-siella pneumoniae)基因组中,克隆PDOR基因dhaT。构建表达载体pDK-dhaT,在E.coli DH5α中利用IPTG诱导进行表达。细胞裂解液利用硫酸铵盐析、Sephadex G-200凝胶层析和DE23 Cellulose阴离子交换层析,进行酶蛋白分离提纯。结果:用SDS-PAGE分析表明胞内PDOR占可溶性蛋白的39.8%,酶活为14.5U/ml。纯化后酶液比酶活提高3.94倍,回收率为15.5%。结论:成功地构建了PDOR高效表达载体,并且得到了高纯度的PDOR。

丁酸梭菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的克隆及在大肠杆菌中的表达

以丁酸梭菌(Clostridium butyricum)基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT,将它连接到pMD 18-T载体上,得到重组质粒pMD-dhaT,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,dhaT基因全长为1 158 bp。将dhaT基因插入表达载体pSE-380中,构建成重组子pSE-dhaT,并在大肠杆菌JM109中进行诱导表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在37℃下,以1.0 mmol/L IPTG诱导14h,酶活力达到16.28 U/mL,比原始菌株提高5.6倍。

1,3-丙二醇氧化还原酶及其工程菌研究进展

作为合成许多缩聚物单体的1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是本世纪具有广阔市场潜力的化工原料,在化工、医药、食品等领域具有广泛的应用.介绍了1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR,EC 1.1.1.202)在1,3-PD生产菌代谢途径中的作用,着重综述了PDOR的基因克隆表达情况及其性质特点,分析了PDOR的晶体结构,同时对1,3-PD生物法生产中工程菌的研究进展进行了详细的介绍,并展望了生物法生产1,3-PD的前景,该文有助于加深对PDOR及其工程菌的了解,使其得到更多研究者的重视.

克雷伯杆菌甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的动力学机制

本研究主要对克雷伯杆菌甘油转化1,3-丙二醇代谢途径中的2个关键酶甘油脱氢酶(GDH)、1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)反应机制和动力学进行了研究。首先,通过初速度和产物抑制动力学研究确定了GDH、PDOR双底物酶促反应机制为有序BiBi机制,明确了由反应物消耗到产物生成之间的历程。其次,建立了GDH、PDOR双底物酶促反应动力学模型,由动力学模型可知,在偶合反应中,如果GDH和PDOR酶量相同,GDH氧化反应成为限速反应,而辅酶I将主要以氧化型NAD+形式存在。动力学信息为酶法合成1,3-丙二醇和代谢工程研究提供理论指导。

1,2-丙二醇氧化酯化制备高附加值C3化学品

以拟薄水铝石为原料,通过高温焙烧制备γ-Al_(2)O_(3),并以γ-Al_(2)O_(3)为载体,通过吸附还原法制备了3Au/γ-Al_(2)O_(3)催化剂[其中3为m(Au)∶m(催化剂)=3%]。通过TEM、XRD、ICP-OES和BET对催化剂的形貌和结构进行了表征,考察了3Au/γ-Al_(2)O_(3)催化剂在1,2-丙二醇氧化酯化制备高附加值C3化学品的催化性能。结果表明,Au颗粒的高效分散有助于提高催化剂的性能;在优选条件下,以甲醇为溶剂,无碱助剂的体系中1,2-丙二醇的转化率为63.0%,C3化学品总选择性为63.6%;并且发现增加催化剂中Au负载量,可能会影响反应的发生,从而降低主产物的选择性。

共表达1,3-丙二醇氧化还原酶与甲酸脱氢酶对Klebsiella pneumoniae生理代谢的影响

针对1,3-丙二醇发酵过程中中间代谢产物3-羟基丙醛致死性的现象,在野生型的克雷伯氏肺炎杆菌中同时强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶,在增强1,3-丙二醇氧化还原酶酶活的同时,促进NADH的合成,最终降低3-羟基丙醛积累.利用PCR技术分别从克雷伯氏肺炎杆菌和甲醇酵母Candida boidinii基因组中扩增出基因dhaT和fdh,通过表达载体pDK获得1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶共表达的菌株K.p/pTF在IPTG的诱导下,基因工程菌K.p/pTF1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶的酶活分别提高了2.8倍和3.5倍,而NADH含量提高了1.3倍.在有氧条件下批式发酵培养,基因工程菌K.p/pTF可以利用以50g/L的初始甘油为底物正常进行发酵,3-羟基丙醛的最高积累浓度较野生菌降低了50.1%,有效避免了发酵的异常中止.