半乳糖凝集素-3基因敲除对MRSA感染小鼠皮肤模型中脓肿发展的影响

目的探讨半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal3)在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染小鼠皮肤模型中对皮肤脓肿发展以及肥大细胞(mast cell,MC)激活的影响。方法将6~8周龄的野生型小鼠和Gal3基因敲除(Gal3^(-/-))小鼠分为4组:野生型小鼠+PBS组、野生型小鼠+MRSA组、Gal3^(-/-)小鼠+PBS组、Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组,分别皮下注射MRSA或PBS,每组5只。观察记录小鼠皮肤脓肿发展和病理学变化,比较皮肤组织中的载菌量,并分析相关炎性细胞因子、MC脱颗粒及活化标志物5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)的差异。结果感染MRSA后,野生型小鼠皮肤出现渐进性脓肿,而Gal3^(-/-)小鼠脓肿体积较小。与野生型小鼠+MRSA组相比,Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组皮肤载菌量显著降低(P<0.01),且组织病理学观察显示较少的炎症细胞浸润。Gal3^(-/-)小鼠皮肤中的细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-33、TGF-β和IL-10均显著低于野生型小鼠(P<0.05)。甲苯胺蓝染色显示,野生型小鼠+MRSA组皮肤组织中大量MC释放颗粒物质,而Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组仅发现少量脱颗粒的MC。免疫组化染色进一步发现,Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组中5-HT的表达显著低于野生型小鼠+MRSA组。结论Gal3缺失降低MRSA感染导致的小鼠皮肤中MC的活化与脱颗粒,改变炎症反应,减轻了皮肤组织的脓肿发生。

敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因五指山小型猪的繁育和鉴定

目的总结α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)五指山小型猪的繁育和鉴定。方法统计GTKO五指山小型猪的繁育结果及窝产仔数;采用聚合酶链反应(PCR)技术对GTKO五指山小型猪GGTA1基因敲除类型进行鉴定;采用荧光显微镜和流式细胞术对人、野生型五指山小型猪、GTKO五指山小型猪外周血单核细胞(PBMC)的α-1,3-半乳糖(αGal)表型进行检测;比较GTKO五指山小型猪与野生型五指山小型猪血常规指标的差异。结果 GGTA1基因型的遗传符合孟德尔定律;GGTA1-/-猪的PBMC流式检测无荧光表达,与基因型鉴定结果一致;GTKO五指山小型猪雌性猪初产窝产仔数为(6.8±1.8)只,经产窝产仔数为(8.3±2.2)只;血常规检测的各项指标与野生型五指山小型猪差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论连续2代GTKO五指山小型猪遗传稳定,繁殖力正常。GTKO五指山小型猪可作为异种器官移植研究的可靠供体。

人外周血单个核细胞分泌细胞因子对α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除猪肝细胞的作用

目的研究异种肝细胞或肝移植中,活化的人外周血单个核细胞(h-PBMC)分泌的细胞因子对α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除猪肝细胞(GalT-KO-hep)的作用。方法利用永生化GalT-KO-hep,与经脂多糖+聚肌胞苷酸激活的h-PBMC共培养。生化分析检测共培养上清中白蛋白、ALT、AST和尿素水平,采用流式细胞术检测GalT-KO-hep凋亡,采用蛋白质印迹法检测GalT-KO-hep中Caspase-3剪切体表达以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)、核因子κB(NF-κB)、P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、信号传导与活化转录因子3(STAT3)和蛋白激酶B(AKT)通路相关分子的表达变化。采用方差分析比较不同刺激时间h-PBMC分泌的细胞因子mRNA相对表达量、共培养模型不同时间点上清液生化指标含量、GalT-KO-hep中Caspase 3剪切体表达量和细胞凋亡率,进一步两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。结果 GalT-KO-hep与活化h-PBMC共培养6 h组上清液中ALT含量高于共培养24 h和48 h组,差异均有统计学意义(P均<0.05);共培养48 h组AST含量高于共培养6 h和24 h组(P均<0.05);共培养24 h和48 h组尿素含量均高于共培养6 h组(P均<0.05)。GalT-KO-hep与活化h-PBMC共培养24 h和48 h后,细胞中Caspase 3剪切体表达增加,细胞凋亡程度逐渐增加。与活化h-PBMC共培养0.5、1、6和12 h后,GalT-KO-hep磷酸化蛋白p-STAT3、p-JNK、p-IκBα、p-P38 MAPK、p-AKT和p-ERK(1/2)均被不同程度激活。结论 h-PBMC释放的细胞因子可诱导GalT-KO-hep损伤和凋亡,并促进炎症相关分子通路的激活。

ST3GAL5通过激活PPAR和抑制PI3K/AKT途径抑制膀胱癌的恶性生物学行为

目的研究ST3β-半乳糖苷α-2,3-半乳糖基转移酶5(ST3GAL5)对膀胱尿路上皮癌(BLCA)生物学行为的影响和潜在机制。方法利用生物信息分析确定与膀胱癌相关的差异表达基因。然后筛选出合适的膀胱癌细胞系。体外实验通过细胞计数盒-8(CCK-8)、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、菌落形成实验、转孔迁移、流式细胞仪凋亡实验和划痕实验评估ST3GAL5对膀胱癌生物行为的影响。使用癌症基因组图谱(TCGA)数据库对ST3GAL5基因进行了京都基因和基因组百科全书(KEGG)、基因集富集分析(GSEA)。最后,使用Western-blot技术验证其增殖和转移的相关通路。结果生物信息学分析和实验测量的结合表明,ST3GAL5的表达在人类的BLCA细胞系中是异常下调的。通过癌症细胞系百科全书(CCLE)数据库,成功筛选出HT-1376细胞系进行体外实验。实验结果发现上调ST3GAL5后膀胱癌的恶性生物学行为被抑制。GSEA富集分析显示,ST3GAL5及其共表达的基因通过激活PPAR途径和抑制PI3K/AKT途径抑制了膀胱癌的细胞增殖、侵袭和转移。Western-blot实验结果验证了ST3GAL5在膀胱癌中过表达后,PPAR信号通路的关键蛋白出现了明显的增加,PI3K/AKT信号通路的关键蛋白出现了明显的减少(P<0.05)。结论ST3GAL5基因可能作为膀胱癌的致癌抑制基因,可能通过激活PPAR信号通路和抑制PI3K/AKT信号通路的相关分子来抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和转移。

一种新的非Gal异种移植抗原——FAM234A的鉴定

目的探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原。方法用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴。将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的未知抗原。采用流式细胞术测定PAEC表面结合的猴抗猪细胞抗体的平均荧光强度(MFI),用以表示PAEC表面抗原的含量。利用慢病毒介导的短发夹核糖核酸(shRNA)敲减PAEC中的FAM234A基因,检测该细胞结合的猴抗猪细胞抗体含量是否减少,以确定该基因是否为潜在的移植抗原。结果 PAEC中的非Gal抗原能够在猴体内引发大量的猴抗猪细胞抗体。在GTKO小型猪的PAEC中用shRNA敲减FAM234A基因后,PAEC结合的猴IgG抗体减少。结论 FAM234A是一种新的非Gal异种移植抗原。

异种心脏移植的研究进展

心脏移植是终末期心力衰竭的有效治疗方式,但捐献供体短缺是困扰临床心脏移植的瓶颈问题。根据世界卫生组织的统计,全球每年约有200万人需要器官移植,但每年仅有3万人接受移植手术。虽然机械辅助装置(如心室辅助装置、人工心脏)可作为心脏移植的临床替代选择,但相关的出血、血栓、感染及生活质量等问题限制了其临床应用。

GGTA1基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猕猴3例报道

目的探索GGTA1基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猴的效果。方法本研究采用GGTA1基因敲除新生猪胰岛细胞开展了3例猪-猴异种胰岛移植实验。结果3只猕猴成功进行胰岛细胞移植治疗,术后生命体征平稳,未发生静脉栓塞症状。移植后血糖和外源胰岛素用量均显著降低,能检测到特异性猪C肽。移植后3只猕猴均发生了酮症酸中毒症状,1只猕猴发生伤口感染,经对症处理后均健康存活达16周。结论GGTA1基因敲除新生猪胰岛细胞经肝门静脉移植治疗1型糖尿病的方法是有效的。

A血型亚型与糖基转移酶活性关系的初步研究

目的:通过研究A亚型等位基因及其编码糖基转移酶的活性,进而了解不同A亚型的抗原性。方法:血型表型的定型采用微孔板法初检,试管法确认;糖基转移酶活性的检测采用血清学试管法;A血型亚型等位基因的检测采用DNA分子测序的方法。结果:在与抗A1不凝集的8例A亚型、24例A亚型B的标本中,无α-1、3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性的分别为7例和24例;在与抗A1弱凝集的6例A型、13例AB型标本中,出现酶活性的分别为1例和4例。95.45%(42/44)的A亚型无α-1、3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性。结论:从本次初步研究看绝大部分的A亚型无α-1、3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性。不同A等位基因其A亚型的抗原性有差别。

人血清中非Gal异种抗体检测方法的探讨

目的探讨人血清中抗非半乳糖(Gal)异种抗原抗体的最佳检测条件。方法选用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪的外周血单核细胞(PBMC)作为靶细胞,与健康人血清混合,在不同血清浓度(4.8%、16.7%、100%)和孵育时间(0.5、1.0、2.0、3.0、6.0 h)条件下,利用流式细胞仪检测GTKO猪的PBMC上结合IgM和IgG的水平。结果在16.7%血清浓度下,孵育时间从0.5 h延长至3.0 h,能显著提高非Gal IgM结合PBMC的水平(P<0.01),而IgG水平的提高则差异无统计学意义(P>0.05)。提高血清浓度也可提高非Gal IgM的结合水平,采用100%的血清浓度孵育3 h,IgM结合PBMC水平最高且有统计学意义(P<0.01)。采用100%的血清孵育6 h,IgG结合水平升高有统计学意义(P<0.05)。延长孵育时间和提高血清浓度不会影响PBMC的活力。结论检测人血清中抗非Gal异种抗原抗体的最佳条件为每1×105个猪PBMC,采用100%人血清浓度孵育3 h检测IgM水平,或加100%人血清浓度孵育6 h检测IgG水平。这一条件的优化有助于筛选非Gal表达抗原低表达的供体猪。

异种心脏移植的研究进展

心脏移植是治疗终末期心脏病的一种有效方法,但由于供体的缺乏使其开展受到限制。近年来异种心脏移植(CXTx)的研究取得了显著的进展,为心脏移植供体短缺提供了一个可行的方案。但由于存在跨物种免疫排斥反应、移植术后无法长期维持心脏生理功能及移植物状态监测欠佳等问题,CXTx仍面临着许多挑战。本文就CXTx在免疫排斥反应、移植方法、异种移植物状态监测等方面的研究进展做一综述并讨论CXTx的临床应用前景及面临的挑战。

五指山小型猪近交系异种移植产业化研发进展

为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-猴异种角膜内皮移植取得突破性进展、WZSP近交系PERV无传染性群体建立、WZSP近交系是理想的动物模型和异种移植供体等方面,介绍WZSP近交系异种移植产业化的研发进展。

应用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究B4GalT7基因对丙型肝炎病毒感染的影响

目的应用CRISPR/Cas9系统建立B4GalT7基因敲除的Huh-7.5细胞株,进而验证其对丙型肝炎病毒(HCV)感染的影响。方法针对人源B4GalT7基因设计3个不同的sgRNA,构建同时表达Cas9和sgRNA的慢病毒转移质粒,制备重组慢病毒并转导Huh-7.5细胞,用嘌呤霉素筛选细胞克隆,提取细胞克隆的基因组DNA,对sgRNA靶点附近的DNA片段进行PCR扩增,纯化PCR产物测序分析鉴定,并用Western blot进一步验证B4GalT7蛋白表达情况。成功建立基因敲除细胞株后,比较其与野生型Huh-7.5细胞株对HCV的易感性。结果成功建立了B4GalT7基因敲除的Huh-7.5细胞株,证明HCV对该细胞株的感染能力明显低于野生型Huh-7.5细胞株。结论 B4GalT7基因敲除可显著减弱HCV对细胞的感染。

异种肝移植术后组织因子激活介导受体凝血功能障碍的机制

目的探讨异种肝移植术后导致受体凝血功能障碍的组织因子(TF)激活机制。方法实施3例α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪-藏酋猴异种脾窝异位辅助性肝移植术。观察受体术后凝血功能变化情况。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学染色检测移植术前及术后不同时间点受体原肝和移植肝组织的猴TF及猪TF信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达情况。检测正常对照猴、移植术前受体猴及移植术后2 h受体猴的外周血单核细胞(PBMC)的复钙时间以评价受体凝血状态。结果 3例受体在术后均出现了不同程度的凝血功能障碍,表现为纤维蛋白原水平降低、血小板计数减少。猴TF蛋白在术后受体原肝中呈阳性表达,在术前及术后的移植肝中呈阴性表达;而猪TF蛋白在原肝和移植肝中始终为阴性表达。术后2 h,猴TF mRNA在原肝中较术前上调(2.10±0.24)倍,而猪TF在移植肝中较术前上调(1.42±0.15)倍,两者比较差异有统计学意义(P=0.014)。与正常对照猴PBMC和移植术前受体猴PBMC比较,术后2 h受体猴PBMC复钙时间明显缩短,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。结论在异种肝移植术后凝血功能障碍发生时,受体原肝TF激活程度显著高于移植肝TF。受体原肝TF激活是导致异种肝移植术后凝血功能障碍的主要原因。

一例ABO血型A亚型个体的ABO基因序列分析与家系调查

目的分析1例A亚型献血者的ABO血型血清学特性及相关的血型基因。方法用试管凝集法检测样本的ABO血型表型；用尿二苷酸N-乙酰半乳糖胺转移实验确定血型糖基转移酶的活性；用血凝抑制实验检测血型分泌型物质；ABO基因的第6-7外显子序列通过PCR扩增后直接测序分析，并对扩增产物进行克隆测序。结果该例表型为A亚型的先证者为非分泌型，血浆中无α-1、3M乙酰半乳糖基转移酶活性，DNA测序结果显示在第6外显子为nt．261del／G、297A／A，第7外显子为nt．467C／T、806T／C和1009A／G杂合，克隆测序显示一个等位基因为A205，另一个为001等位基因并有nt．806T〉C，该先证者的基因型为A205／Onew（806T〉C）。后者经比对为新的突变，新序列被提交至GenBank（序列号为KP341759）。家系调查结果显示其父亲基因型为Onew（806T〉C）／002，母亲基因型为A101／A205。先证者的新等位基因来自其父亲。结论该标本A抗原性减弱的原因为A205亚型等位基因引起，并存在一个新的O等位基因。

异种心脏移植基因修饰策略及围手术期管理研究进展

异种心脏移植(CXTx)为解决终末期心衰患者心脏移植供器官短缺提供了广阔的发展前景,是缓解供心短缺的可行策略。人源化基因修饰技术的进步为CXTx临床应用翻开了新篇章。CXTx动物模型的建立为解决异种排斥反应探索出一条可行的技术路线,显著延长移植器官存活时间。本文综述近年来异位和原位CXTx的研究进展,并从多项前瞻性临床前研究的数据中筛选出部分相关数据进行分析,探讨CXTx动物模型的构建策略及可能优化的治疗方案,以期为临床提供借鉴。