α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默载体的构建

根据小鼠α-1,3-GT基因mRNA序列设计并合成了特异性的发夹状RNA干扰序列,以pCDNA3为基本骨架,选取人类H1启动子,构建了针对小鼠-α1,3-GT基因的特异性基因沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础。

α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默小鼠的建立初探

目的获得转α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因的小鼠。方法将α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因用显微注射的方法导入小鼠受精卵。结果移植注射胚853枚,其中移植312枚1-细胞胚于11只受体鼠,6只受孕(54.5%)均中途流产(解剖发现子宫角明显增粗、充血、残骸);移植注射胚541枚2-细胞胚于23只受体鼠,18只受孕(78.3%),11只受孕均中途流产了,3只足日剖宫产获14只死胎,平均体重2.14g,未检测到阳性;4只12日龄左右剖宫获21只残骸有7只阳性。结论通过显微注射的方法,α-1,3-半乳糖苷转移酶沉默基因可以整合,但要得到整合成活个体还有待进一步研究。

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪

人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应

半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 。

根癌农杆菌介导β-1,4-半乳糖苷转移酶基因转化大豆及其转基因植株再生

以大豆下胚轴为外植体 ,通过根癌农杆菌介导转化法 ,建立起良好的转化系统 ,将人的 β -1 ,4-半乳糖苷转移酶基因 (hGT)导入大豆。经转化的外植体在添加 1 0 0mg/L氨苄青霉素和 5 0mg/L卡那霉素的选择培养基中可诱导出愈伤组织和芽再生 ,在 1 /2MS培养基上诱导生根 ,并培养成再生苗 ,获得了完整的抗性再生植株。进行Southernblot分子杂交鉴定 。

半乳糖-3-O-磺酰基转移酶-2与肿瘤转移关系的研究

半乳糖-3-O-磺酰基转移酶-2(GP3ST)是一个新近克隆的磺酰基转移酶,其生物学功能还不明确.GP3ST在肿瘤细胞和肿瘤组织中差异性表达,以及催化所形成的磺酰化糖链与肿瘤转移潜能密切相关,是首次研究报道.在高转移潜能的肿瘤细胞中,GP3ST及其产物的表达明显高于低转移潜能的细胞,在伴有淋巴结转移的喉癌组织中,GP3ST的高表达率也明显高于无淋巴结转移的喉癌组织(P<0.05),而且在喉癌组织中的表达也明显高于相对应的癌周组织.利用RNAi技术下调肝癌细胞SMMC7721中GP3ST的表达,观察到稳定转染RNAi/GP3ST的细胞形态发生明显的改变,由多边形转变为近似梭形,与TNF-α刺激后的HUVEC和sL-选凝蛋白的黏附能力下降.进一步研究表明,GP3ST表达的下降能抑制细胞中的整合蛋白αV亚基的表达,而β3亚基表达无改变,同时在高转移细胞株中αV的表达也明显高于低转移细胞株,与GP3ST表达的差异性相一致.上述结果充分说明GP3ST催化合成的糖链可通过调节肿瘤细胞的黏附性和影响整合蛋白αV亚基的表达参与肿瘤转移.

广西巴马小型猪α-1，3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定

目的通过RT-PCR扩增巴马小型猪GGTA1基因，分析其序列的结构特点并构建真核表达载体。为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础。方法根据NCBI上发布的猪α-1，3半乳糖转移酶基因cDNA序列（AF221508），设计合成一对含有HindⅢ和BamHI酶切位点的特异性引物，以广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板进行RT-PCR，所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序；将目的基因与pEGFP-N1进行双酶切后连接构建真核表达载体pEGFP-GGTA1，通过测序，双酶切鉴定。结果所克隆的广西巴马小型猪GGTA1基因存在缺失第五外显子（81．116）的GGTA1序列。序列全长1080bp和未缺失第五外显子的GGTA1序列，全序列为1116bp。构建两个表达载体（缺失第五外显子pEGFP．GGTA1-1、未缺失第五外显子pEGFP-GGTA1-2）。结论广西巴马小型猪GGTA1基因存在第五外显子缺失的现象，通过对GGTA1基因克隆序列进行分析以及构建两个真核表达载体，为后面在猪源PK-15细胞中对其进行表达鉴定以及巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因的沉默实验奠定基础。

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。

大肠癌组织中β-半乳糖苷结合蛋白-3与β-葡萄糖醛酸苷酶表达的意义

目的:通过观察β-半乳糖苷结合蛋白-3(Galectin-3)与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-G)在大肠癌组织中的表达,与大肠癌的生物学特征进行比较,以探讨其临床意义.方法:采用SP免疫组织化学方法检测98例临床新鲜标本,其中包括15例癌旁正常大肠黏膜组织及83例大肠癌组织中galectin-3和β-G的表达情况,并进行两种蛋白的表达相关性分析.结果:Galectin-3和β-G蛋白在浸润程度深、分化程度低及Dukes分期较晚的大肠癌组织中的表达高于浸润程度浅(0.15±0.03 vs 0.16±0.05,P=0.02)、分化程度高(0.15±0.012 vs 0.16±0.03,P=0.03)及Dukes分期较早(0.18±0.06 vs 0.17±0.05)的大肠癌组织(P<0.05);在大肠癌组织中,ga-lectin-3的表达和β-G的表达呈正相关(r=0.628,P<0.01).结论:Galectin-3和β-G的异常表达在大肠癌的发生、发展中起着重要作用,具有一定的诊断价值.

UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖氨基转移酶3:一个新的磷调节蛋白的调磷机制

UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖氨基转移酶3(ppGalNacT3)是催化成纤维细胞生长因子23(FGF23)O-糖基化的起始酶,其编码基因GALNT3的突变可以导致以高磷酸盐血症及软组织钙化为特征的高磷酸盐血症型家族性肿瘤样钙化(HFTC)。磷是人体重要的矿物质,参与包括骨骼矿化在内的许多重要生理过程,磷代谢紊乱可以导致骨骼矿化障碍,引起骨软化、骨质疏松等代谢性骨病的发生。磷稳态的调节对骨骼健康有非常重要作用。本文就一个新近发现的磷调节相关蛋白ppGalNacT3的结构和功能进行综述,并试阐述其调节血磷的机制以及对骨骼矿化的影响。

多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2与共刺激分子B7-H3相互作用的结构信息学初步探讨

目的 研究多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2（ppGalNAc-T2）与共刺激分子B7-H3的相互关系.方法 通过同源模拟,得到共刺激分子B7-H3两种不同剪接体（2IgB7-H3,4IgB7-H3）的分子结构,寻找PDB数据库中的ppGalNAc-T2的蛋白质晶体结构,利用软件GRAMM（http：//vakser.bioinformatics.ku.edu/main/resources_gramm.php）,与同源模拟得到的两种不同剪接体的B7-H3分子结构相结合,寻找两者之间是否存在直接结合的可能.结果 成功地模拟了共刺激分子B7-H3两种剪接体的分子结构,发现ppGalNA-T2与共刺激分子B7-H3有相互结合的可能性.结论 结构生物信息学的研究发现ppGalNAc-T2分子与B7-H3具有潜在相互作用位点,ppGalNAc-T2可能参与B7-H3蛋白质的O-糖链合成反应,并且很有可能是通过直接接触来催化控制B7-H3分子的O-糖链合成.

人α-半乳糖苷酶转导克服异种移植HAR的小鼠实验研究

α 半乳糖苷酶可以特异地清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 (Galα1,3Galantigen) ,此抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (HyperacuteRejection ,HAR)的主要异种抗原 .将构建好的α半乳糖苷酶转基因载体通过显微注射的方式注入小鼠受精卵 ,培育出了转基因小鼠 .结果表明 ,转基因小鼠的心、肝、肾、脾、肺组织中均有人α 半乳糖苷酶基因的表达 ,其表达可以有效减少小鼠器官表面Galα1,3Gal抗原的表达水平 ,可以降低转基因小鼠脾细胞对补体介导的杀伤作用的敏感性 .研究表明人源α半乳糖苷酶基因可用于研制不表达Galα1,3Gal抗原的转基因动物 ,从而可以降低异种器官移植HAR的反应强度 。

表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型的建立及其在肿瘤DNA疫苗研究中的应用

本文工作的目的是建立以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型,并进行肿瘤免疫的研究。我们首先在pcDNA3质粒中引入一个β-半乳糖苷酶编码基因从而建立转染质粒p3gal。p3gal转染小鼠黑色素瘤细胞B16后,再通过G418筛选及X-Gal细胞染色得到表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株。接着用该细胞株成功地在C57小鼠上建立了表达β-半乳糖苷酶的galB16肿瘤模型。并在此模型上观察了β-半乳糖苷酶编码基因作为DNA疫苗抑制galB16肿瘤生长的作用。

作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶(EmGalase)的鉴定和研究

对脑膜炎败血伊丽莎白金菌进行糖苷酶功能基因组分析发现,该菌存在一个GH27家族α-半乳糖苷酶基因。克隆该基因并表达蛋白后,利用人工合成的pNP底物研究其酶学性质,发现该酶具有α连接的半乳糖(α-galactose,α-Gal)底物特异性,酶反应pH为3.0~8.0,反应温度为4~45 ℃。用不同寡糖底物进一步确定,该酶能够酶切直链末端α-1,3、1,4、1,6Gal。在猪红细胞上进行的酶切实验显示,该酶能够高效清除存在于猪红细胞表面的末端Gal α 1-3Gal表位。末端α-半乳糖基化修饰在免疫与感染中发挥着重要的生物学作用,作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶的发现将为该领域的研究提供一个新的工具,为缓解异种输血中的超急性免疫排斥反应提供一种可能。

METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用

背景:高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血症与胰岛β细胞功能密切相关,但其具体分子机制尚不完全明确。目的:探讨METTL3在Hcy诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用。方法:取第3,4代小鼠胰岛β细胞进行实验。①细胞模型建立和分组:对照组细胞不加入Hcy,Hcy组细胞加入浓度为100µmol/L Hcy干预48h;②按Lipofectamine^(TM) 2000说明书将过表达质粒Ad-METTL3及si-METTL3转染小鼠胰岛β细胞,设计3种不同干扰片段,PCR验证、筛选出干扰效率最好的干扰片段;③转染后实验分组:对照组、Hcy组、Ad-NC(阴性对照)+Hcy组、Ad-METTL3+Hcy组、si-NC(阴性对照)+Hcy组和si-METTL3+Hcy组;④采用qRT-PCR及Western blot检测细胞中METTL3及细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达;ELISA法测定胰岛素水平来评价胰岛β细胞胰岛素分泌能力;分别过表达和干扰METTL3后检测细胞自噬相关蛋白及胰岛素水平。结果与结论:①与对照组相比,Hcy组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平升高(P<0.05),而p62表达明显降低(P<0.05),胰岛素分泌能力明显下降(P<0.05);②与对照组相比,Hcy组中METTL3蛋白及mRNA水平表达均降低(P<0.05);③胰岛β细胞中沉默METTL3后,Hcy进一步上调了细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的表达(P<0.05),而p62表达显著下降(P<0.05),细胞中胰岛素水平增加(P<0.05);过表达METTL3后,Hcy则使LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低且p62表达则增高(P<0.05);④结论:METTL3参与了Hcy诱导的胰岛β细胞自噬调控,对胰岛素的分泌发挥着调控作用。

miR-212-3p靶向MAPK3调控骨髓间充质干细胞的衰老

背景:骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞表现出明显衰老状态,并且细胞活性及成骨分化水平显著降低。miR-212-3p能够抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化,但其对骨髓间充质干细胞衰老调控的作用及机制尚不明确。目的:研究miR-212-3p通过靶向丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)对骨髓间充质干细胞衰老的影响及其机制。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,收集第3代进行以下实验:①分2组培养:对照组加入完全培养基,造模组加入含H_(2)O_(2)的完全培养基培养,培养72 h后,检测细胞中β-半乳糖苷酶活性、miR-212-3p和MAPK3 mRNA表达,以及MAPK3、p16和p21蛋白表达。②分3组培养:对照组、抑制物对照组、miR-212-3p抑制物组,转染24 h后,检测细胞中miR-212-3p、MAPK3 mRNA表达及MAPK3蛋白表达。③采用双荧光素酶报告基因联合qRT-PCR和Western blot验证miR-212-3p与MAPK3靶向调控作用。④分组培养:分为对照抑制物组、miR-212-3p抑制物组、miR-212-3p抑制物+干扰对照组、miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组,转染24 h后,检测细胞中MAPK蛋白与mRNA表达。分为对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+对照抑制物组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+干扰对照组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组,细胞转染24 h后再加入H_(2)O_(2)培养72 h,检测细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶活性、p16和p21蛋白表达。结果与结论:①与对照组比较,造模组β-半乳糖苷酶活性、miR-212-3p mRNA表达及p16、p21蛋白表达升高(P<0.05),MAPK3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。②与对照组比较,miR-212-3p抑制物组细胞中miR-212-3p mRNA表达降低(P<0.05),MAPK3 mRNA与蛋白表达升高(P<0.05)。③双荧光素酶报告基因实验证实,MAPK3是miR-212-3p下游靶基因。④与对照抑制物组比较,miR-212-3p抑制物组细胞中MAPK3 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05);与miR-212-3p抑制物组比较,miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组细胞中MAPK3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与H_(2)O_(2)+对照抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组β-半乳糖苷酶活性降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)+对照抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组细胞中p16和p21蛋白表达降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组细胞中p16和p21蛋白表达升高(P<0.05)。⑤结果表明,下调miR-212-3p可抑制大鼠骨髓间充质干细胞衰老,其作用机制可能是通过靶向上调MAPK3表达实现的。

PCR法构建小鼠α-1,3-GT基因沉默载体研究

在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列,针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,然后把该序列克隆到pGEM-T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础。

柚皮苷调节GALNT2-ANGPTL3通路改善小鼠的血脂异常

目的测试柚皮苷对小鼠的血脂异常的影响。方法 50只小鼠,随机分为正常对照组、高脂血症模型组、10 mg/kg柚皮苷组、20 mg/kg柚皮苷组、30 mg/kg柚皮苷组,各10只。观察比较五组小鼠肝组织N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(GALNT2)和血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)m RNA表达及血脂[甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]水平。结果与正常对照组比较,高脂血症模型组小鼠GALNT2的表达显著降低,ANGPTL3的表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与高脂血症模型组比较,10 mg/kg柚皮苷组、20 mg/kg柚皮苷组、30 mg/kg柚皮苷组小鼠GALNT2的表达明显升高,ANGPTL3表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。高脂血症模型组TG水平(96.3±6.6)mg/dl和TC水平(211.8±15.5)mg/dl高于正常对照组的(65.7±5.2)、(135.8±7.4)mg/dl,HDL-C水平(32.9±4)mg/dl低于正常对照组的(62.5±6.2)mg/dl,差异有统计学意义(P<0.01);10 mg/kg柚皮苷组、20 mg/kg柚皮苷组、30 mg/kg柚皮苷组的TC和TG及HDL-C水平均优于高脂血症模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论柚皮苷调节GALNT2-ANGPTL3通路改善高脂血症小鼠的血脂异常。

Her-2、E-cadherin和Galectin-3与肠癌患者临床分期及淋巴转移的关系研究

分析人表皮生长因子受体-2(Her-2)、钙粘附蛋白E(E-cadherin)和半乳糖苷酶-3(Galectin-3)与肠癌患者临床分期及淋巴转移的关系,为临床诊断及治疗提供参考。收集本院诊治的肠癌患者临床资料,分析患者血清中Her-2、E-cadherin和Galectin-3与肠癌患者临床分期及淋巴转移的关系,以本院同期健康体检者为对照组。结果显示Her-2、E-cadherin和Galectin-3与肠癌患者临床分期及分化程度有关,且随着肠癌患者临床分期的增加和分化程度的升高,上述蛋白的表达逐步增强(P<0.05);上述蛋白表达也与肠癌患者是否发生淋巴转移有关,发生淋巴转移患者的上述蛋白表达水平明显高于未发生转移患者(P<0.05)。因此,Her-2、E-cadherin和Galectin-3表达水平可能与肠癌患者临床分期及淋巴转移密切有关。

本氏烟β-1,3-半乳糖苷转移酶基因鉴定、进化及表达分析

β-1,3-半乳糖苷转移酶(beta-1,3-galactosyltransferase,β-1,3-GalT)是植物中特有的酶,作为蛋白质糖基化修饰通路中的重要酶,它可以催化β-1,3键将半乳糖苷转移至糖核心.本研究将本氏烟(Nicotiana benthamiana)作为材料,对其基因组中β-1,3-GalT同源基因进行了系统的鉴定,共得到12个基因.这些基因编码的蛋白序列均包含保守结构域PF00337和PF01762.将本氏烟12个β-1,3-GalT基因与栽培烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的β-1,3-GalT基因进行聚类分析,表明它们分化为2个主要枝(I和II),每个主要枝又进一步分化为2个亚枝.多数基因在根中表达量均较高,然而仅有6个基因在叶片中高表达.采用qRT-PCR,测定在叶片中高表达的6个β-1,3-GalT基因在农杆菌侵染情形下的表达水平,结果表明处于II枝上的基因表达均受到农杆菌侵染的显著诱导,而处于I枝上的基因无论对农杆菌侵染还是对照重悬液的注射,均表现一定程度的表达量的升高,暗示创伤胁迫可能使相应的基因表达升高,从而促进β-1,3-GalT酶进行糖基化修饰反应.