基于衍生化3-氨基-2-恶唑烷酮的夹心酶联免疫分析

建立一种3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)夹心免疫检测方法。通过1,6-己二醇连接2-硝基-4-羧基苯甲醛和生物素合成针对AOZ的新型衍生试剂。在样品前处理时加入衍生试剂可对AOZ进行衍生,衍生产率为89%。在酶标板上包被抗AOZ单克隆抗体并以辣根过氧化物酶标记的亲和素或抗生物素抗体作为第二结合物可实现AOZ的夹心酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)。从实际应用的角度,得到双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下两个表位的极限距离,分别为12Å和13Å,理想距离分别为16Å和17Å。在双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下的检出限分别达到1.8 pg/mL和0.8 pg/mL(以AOZ质量浓度计),相对于竞争ELISA,其灵敏度最高提高了25倍。平均回收率为73%~85%,平均相对标准偏差为9.0%。

鳗鲡肌肉冻干粉中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷酮残留标准物质的研制

建立了鳗鲡肌肉冻干粉中3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)残留分析标准物质的研制和定值方法。以约0.16mg/L呋喃唑酮对鳗鲡进行药浴给药,使呋喃唑酮在鱼体中代谢,从而使鳗鲡肌肉中含有一定浓度的呋喃唑酮代谢物AOZ。经冻干、真空包装及辐照等处理后获得1批400个独立包装的肌肉冻干粉样本。经过均匀性与稳定性检验,由11家实验室采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法进行协同定值,并进行了不确定度评估,已被国家质检总局批准确为国家二级标准物质。

呋喃唑酮及其代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮在鲤鱼体内的残留规律

采用高效液相色谱法(HPLC法)研究呋喃唑酮[3-(5-硝基糠醛缩氨基)-2-恶唑烷酮](FZ)在鲤鱼体内的残留规律.结果表明,采用单剂量口灌90 mg.kg-1的FZ,鲤鱼肌肉中FZ含量在停药1 h后达到最高值,为(201.9±7.6)μg.kg-1,在停药后的36 h检测不到FZ,其消除半衰期为4.9 h,平均消除速率为8.5μg.kg-1.h-1.同时还采用高效液相色谱—串联质谱检测方法(HPLC-MS/MS法)进行FZ的主要代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的残留规律研究.结果表明,FZ在鲤鱼体内代谢较快,而AOZ却很难消除.鲤鱼肌肉中AOZ含量在停药6 h后达到最高值,为(227.3±9.6)μg.kg-1,停药24 d后残留量为0.6μg.kg-1,其消除半衰期为91.2 h,平均消除速率为0.4μg.kg-1.h-1.

测定食品中呋喃它酮代谢物3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫吸附法

目的 建立以多克隆抗体为基础的测定食品中呋喃它酮代谢物3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的间接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA).方法 以4-甲酰基苯氧基乙酸(4-FPA)为修饰剂,合成AMOZ半抗原衍生物,并使其分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)交联制备得到免疫原和包被抗原,经免疫动物(兔),获得抗NPAMOZ(AMOZ与衍生化试剂2-硝基苯甲醛所形成的结合物)的多克隆抗体.用酶联免疫分析法测定AMOZ(以NPAMOZ形式).结果 在包被抗原为2.5 ng/mL,抗体为1:300 000稀释,酶标二抗为1:10000稀释的优化条件下,ELISA测定AMOZ(以NPAMOZ形式)的IC50值(标准曲线中吸光度抑制至最大吸光度值50％时所对应的待测物浓度)为1.86 ng/mL.抗体与呋喃它酮的交叉反应率较高(70.7％),与AMOZ的交叉反应率仅为0.32％,与其余三种硝基呋喃抗生素及它们的代谢物以及其它八种药物的交叉反应率很小(＜0.01％),表明抗体的特异性高.四种市售的肉样(鱼肉、虾肉、鸡肉、猪肝)用作加标实验,加标浓度分别为0.5、1.0和5.0 ng/g,加标样品经衍生化处理后用ELISA测定,回收率为75.6％～112.2％,批间相对标准偏差(RSD)为8.3％～17.5％.结论 本法具有高灵敏性和高特特异性,能用于动物产品中AMOZ的检测.

碳酸二甲酯羰基化合成3-氨基噁唑烷酮-2

开发出了3 氨基口恶唑烷酮 2的碳酸二甲酸羰基化合成清洁工艺,并考察了催化剂、原料配比、反应时间以及反应精馏等多种因素对过程的影响,从而确立了较佳的工艺条件。

碳酸乙烯酯合成3-氨基-2-噁唑烷酮的热力学分析

采用碳酸乙烯酯与水合肼为原料合成了3-氨基-2-噁唑烷酮,采用Benson基团贡献法和Joback法对反应的热力学进行分析,计算了反应焓变、吉布斯自由能和反应平衡常数。

新型3-氨基-2-唑恶唑烷酮类化合物的合成及群体感应抑制活性评价

目的发展具有群体感应(QS)抑制活性的3-氨基-2-吃恶唑烷酮类化合物。方法以2-肼基乙醇为原料,经过环合,缩合,水解再缩合的方法合成了一系列以3-氨基-2-吃恶唑烷酮为母核的化合物。并对目标化合物进行紫色色杆菌QS抑制活性评价。结果本研究得到目标化合物8个,结构均经1H NMR、MS确证。生物活性评价结果表明,化合物Z2对紫色色杆菌QS有抑制活性。结论所合成的化合物均未见文献报道,合成路线简单稳定可靠。化合物Z2对QS有一定的抑制活性。

呋喃唑酮代谢物AOZ在斑点叉尾体内组织分布与消除规律研究

研究了在池塘网箱养殖模式下,平均水温为30.6℃,以100 mg/kg鱼体重的剂量投饲斑点叉尾(Ietalu-rus punetaus)苗种(95±20.9)g含呋喃唑酮的药饵,连续5 d,每天2次。采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-ESI/MS/MS)法分析了呋喃唑酮主要代谢产物3-氨基-2-噁唑烷酮(3-amina-2-oxazolidinone,AOZ)在斑点叉尾体内的组织分布与消除规律。结果表明:血液、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏中AOZ于停药后在4 h时的浓度分别为(2 649.0±463.1)ng/mL,(1 169.4±194.5)、(2 308.5±100.5)、(7 816.2±568.5)和15 938.1μg/kg,血液、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏中AOZ在60 d时平均浓度分别为6.66 ng/mL,4.50、33.7、17.1和21.3μg/kg,分别是AOZ判定限1μg/kg的6.66、4.5、33.7、17.1和21.3倍。90 d时AOZ在血液和各组织中均检测不到。AOZ在血液和各组织中的浓度水平肾脏>肝脏>皮肤>血液>肌肉,消除半衰期T1/2皮肤(11.1 d)>肌肉(7.8 d)>血液(7.2 d)>肝脏(6.9 d)>肾脏(6.7 d)。斑点叉尾皮肤中AOZ的浓度高于肌肉组织,而且残留时间长,在此养殖条件下,AOZ在斑点叉尾各组织中消除至少需要2 754℃.d。

基于不同半抗原的呋喃唑酮代谢物免疫检测方法的建立与比较

为实现呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone,AOZ）的快速定量检测,制备AOZ-牛血清蛋白单克隆抗体,建立2种分别基于抗3-（4-羧基苯亚甲基）-氨基-2-恶唑烷酮（CPAOZ）、抗AOZ的单克隆抗体酶联免疫检测试剂盒.CPAOZ检测试剂盒在1.0～100.0 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为14.6 ng/mL,检测限为6.56 ng/mL,回收率为97.6％～101.3％;AOZ检测试剂盒在0.5～12.5 ng/mL范围具有良好线性,IC50值为3.9 ng/mL,检测限为0A5 ng/mL,回收率为94.1％～97A％.这2种检测试剂盒对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢物均不存在交叉反应.从经济、方便、快速、灵敏等因素来考虑,后者更具有发展前景.

动物性食品中呋喃唑酮代谢物酶联免疫检测方法的研究

3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)是硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮在动物体内的稳定代谢物,通过选用对醛基苯甲酸对AOZ进行衍生制得CPAOZ,以CPAOZ作为半抗原,再与载体蛋白连接制成免疫原,经过免疫,制得多克隆抗体。经过筛选纯化得到的抗体,用直接竞争酶联免疫检测方法得CPAOZ检出限为0.2μg/L,且与其他抗生素无交叉反应,抗体特异性好。

免疫化学方法测定动物组织中呋喃唑酮残留标示物

以自制特异性抗体为核心试剂,建立了以苯甲醛为衍生试剂的呋喃唑酮残留标示物间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定法和间接竞争法确定ELISA方法最佳反应条件:抗原最佳包被浓度200μg/L,抗体最佳稀释倍数1∶2.5×105,抗体与药物最佳工作配比40μL∶60μL,最佳竞争时间1h。检出限为0.1μg/L,检测范围0.1～25.6μg/L,线性关系良好。在空白组织中(猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏、鱼肉)添加0.4、1.0和5.0μg/kgAOZ,回收率55.8%～96.6%,相对标准偏差均小于20%。测定20份不同组织的空白样品,方法的检出限为0.4～0.5μg/kg。以100mg/kg呋喃唑酮饲喂动物,其组织样品同时经HPLC方法和本方法测定,数据表明本方法具有实际检出能力,测定结果与仪器方法的测定结果相近。通过与德国同类试剂盒比较实验表明,本方法的灵敏度、精密度、准确度接近于进口试剂盒水平,可用于动物可食性组织肝脏和肌肉中AOZ筛选。

间接竞争ELISA法检测呋喃唑酮代谢物

以人工抗原和特异性抗体为基础，建立了以2-硝基苯甲醛为衍生试剂检测呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定和间接竞争法确定ELISA方法的抗原抗体的最佳工作浓度；得到标准曲线的线性范围为0．25-10ng／mL，线性关系良好；根据标准曲线计算IC50为0．5881-1．1333ng／mL。此外，检测了与其他类似物的交叉反应率，显示了很好的特异性；并且通过对虾样品添加回收率的测定，证明了该方法的准确性。高温短时间衍生化处理可达到与37℃孵育过夜同样的衍生效果。

呋喃唑酮及其代谢物在牙鲆肌肉组织中的代谢动力学研究

采用高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱联用法分别测定牙鲆肌肉组织中的呋喃唑酮及其代谢物3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)的残留浓度。在(22±2)℃条件下,研究了单剂量口灌条件下(以80mg/kg计),呋喃唑酮及其代谢物AOZ在牙鲆肌肉中的代谢规律。结果显示:1)呋喃唑酮在牙鲆肌肉组织中的药-时曲线出现明显的双峰现象,非房室模型统计矩原理分析药动学数据,第一次达峰时间Tmax(1)出现在2h,第一次达峰浓度Cmax(1)为3060.5μg/kg;第二次达峰时间Tmax(2)出现在8h,第二次达峰浓度Cmax(2)为508.3μg/kg;药-时曲线下面积AUC为10.9;平均滞留时间MRT为6.9h,说明呋喃唑酮在牙鲆体内吸收较迅速,消除时间较短。2)代谢物AOZ在牙鲆肌肉中的药代动力学模型符合二房室模型,一级吸收速率常数Ka为0.2,吸收半衰期t1/2Ka为3.2h,分布半衰期t1/2α为4.2h,消除半衰期t1/2β为95.1。说明代谢物AOZ在牙鲆体内吸收、消除所需时间较长,直至停药后528h仍然能够检测到残留。

酶标抗原直接竞争ELISA方法检测呋喃唑酮代谢物残留

采用酶标抗原建立了高效、高灵敏的呋喃唑酮代谢物直接竞争的ELISA检测方法。以呋喃唑酮单克隆抗体包被作为固相抗体，HRP标记的抗原与标准品（或样品）中呋喃唑酮的代谢物衍生物竞争结合抗体，建立了直接竞争酶联免疫检测体系。以3-氨基-2-恶唑烷酮的衍生物（CPAOZ）为标准品建立标准曲线，得到方法的IC50为0．08μg/L，灵敏度为0．015μg/L，线性范围0．025～0．5μg/L；检测样品的平均回收率为82．0％～121．0％，与其他结构类似物基本无交叉反应。建立呋喃唑酮酶标抗原直接竞争酶联免疫检测方法，灵敏度高、特异性强、操作简单，可以满足畜禽水产实际样品的检测需要。

酶联免疫法检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留

用酶联免疫试剂盒（灵敏度为0.125μg/kg）检测威海出口水产品中3氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）的残留,测定试剂盒的加样回收率。结果表明除个别产品不符合规定外,绝大部分水产品符合规定,试剂盒在添加量为0.45、0.90、1.80μg/kg时,回收率分别为94.37%、98.78%、97.90%。酶联免疫法适合对水产品中AOZ的残留做快速检测。

利用ELISA试剂盒测定蜂王浆中呋喃唑酮代谢物AOZ

本研究建立了一种用普通动物源食品呋喃唑酮酶联免疫(ELISA)检测试剂盒检测蜂王浆中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)残留量的方法体系,该体系包括采用10%磺基水杨酸作为蛋白沉淀剂和衍生的酸性环境,用乙酸乙酯进行液液萃取后采用ELISA试剂盒进行测定,然后用蜂王浆基质校正标准溶液制作工作曲线并进行计算。此方法在0.1～10μg/kg添加范围内,平均添加回收率为60%～121.7%,批内相对标准偏差为0.62%～9.02%,批间相对标准偏差为2.8%～13.7%,最低检测限为0.1μg/kg。该方法灵敏度高,重复性较好,适用于蜂王浆中呋喃唑酮代谢物残留的筛选。

化学发光酶免疫法测定动物源性食品中呋喃唑酮代谢物的含量

目的建立化学发光酶免疫法(chemiluminescent enzyme immunoassay, CLEIA)测定动物源食品中呋喃唑酮代谢物的分析方法。方法通过使用N-羟基琥珀酰亚胺酯法将衍生的CPAOZ半抗原与卵白蛋白(ovalbumin, OVA)缀合以合成包被抗原,优化CLEIA酶免疫方法的主要条件。对CLEIA酶免疫法的灵敏度、特异性、精密度及准确度进行评价,并就准确度指标同国家标准中的液相色谱串联质谱法进行对比分析。结果包被原和单克隆抗体稀释倍数分别为4000倍和1600倍, 1%脱脂乳封闭,竞争时间30 min, HRP-IgG孵育时间60 min时为最佳条件。CLEIA的线性方程为Y=-0.357X+1.459(r^2=0.984), IC50为0.486 ng/mL,线性范围为0.070～3.362 ng/mL。回收率在87.9%～92.6%之间,批内和批间变异系数分别为3.6%～7.5%和3.2%～6.3%。结论该方法简单,快速,可用于实验室或现场动物源性食品的AOZ筛选。

抗呋喃唑酮代谢物单链抗体基因构建及蛋白结构分析和活性鉴定

从单克隆杂交瘤细胞出发,构建抗3-氨基-2-噁唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)衍生物单链抗体基因,并对其蛋白质进行理化性质分析及结构预测和活性鉴定。首先以呋喃唑酮代谢物AOZ衍生物单克隆抗体杂交瘤细胞1D2为原料,提取总RNA后克隆重链(V_(H))、轻链(V_(L))可变区基因,然后使用重叠延伸聚合酶链式反应技术用连接肽(G_(4)S)_(3)将V_(H)、V_(L)基因连接构建抗AOZ衍生物单链抗体基因,经测序后采用生物信息软件对抗体编码的氨基酸序列进行推导并展开生物信息学分析,再将此基因与Plip6/GN表达载体连接后进行表达并采用直接竞争酶联免疫分析法(direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay,dcELISA)鉴定其活性。结果表明:抗AOZ衍生物单链抗体基因全长750 bp,编码250个氨基酸,相对分子质量为27012.20,理论等电点为9.13,属于碱性氨基酸;其二级结构预测结果显示抗体蛋白含20处α-螺旋、25处β-转角、114处无规卷曲、91处延伸带结构;三级结构预测的正面俯视图显示重、轻链由连接肽相连形成一个“环桶状”结构,侧面显示为“口袋状”,这与常规单链抗体的结构特征一致,dcELISA结果也显示该抗体具有良好的抗原结合活性。本研究为后续AOZ残留检测免疫分析方法的建立及抗AOZ衍生物单链抗体的改造奠定一定基础。

呋喃唑酮代谢物(AOZ)在异育银鲫、团头鲂鱼种体内降解规律的初步研究

为研究呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)在异育银鲫、团头鲂鱼种体内的降解规律,用呋喃唑酮按30 mg·kg-1·d-1的水平投喂药饵,连喂7 d后随机抽取试验鱼,取肌肉组织进行连续采样检测,运用HPLC/MS/MS检测并分析AOZ在两种鱼类体内的消除规律。结果发现:14周后,AOZ的浓度在异育银鲫体内降解到检出限(0.5μg/kg)以下;36周后,在团头鲂体内降解到检出限以下。这一结果提示,一旦养殖鱼类被呋喃唑酮污染,很难在短时间内消除,会影响水产品的质量安全并对人体健康造成危害。