3-甲基腺嘌呤对鸡LMH细胞脂代谢的影响机制研究

本研究围绕自噬与鸡肝脏脂代谢机制展开.首先使用3组不同浓度(2.5 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L)3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)分别处理鸡肝癌细胞(Leghorn Male Hepatocellular cells,LMH)24 h和48 h,然后提取细胞的总RNA,利用RT-qPCR检测自噬相关基因在mRNA水平的表达情况,筛选出3-MA的最佳抑制浓度和时间,并检测最佳条件3-MA处理鸡LMH细胞后脂代谢相关基因的表达情况.结果表明,使用2.5 mmol/L的3-MA处理鸡LMH细胞24 h后,基因Atg3、Map1lc3a、Becn1的表达量在mRNA水平出现下调,与预期相符,即为最佳条件.使用该条件的3-MA处理鸡LMH细胞后,脂代谢相关基因PPARα、ApoB与Fabp2的表达显著下调,而FASN的表达水平显著上调,Fabp7与FOXO1的表达水平则无显著变化.因此,一定浓度的自噬抑制剂3-MA在体外可促进脂质代谢.

负载3-甲基腺嘌呤介孔二氧化硅的制备与释药性能研究

目的制备唑来膦酸(ZOL)修饰的聚多巴胺(PDA)包覆介孔二氧化硅(MSN)纳米颗粒,对其进行表征及释药性能研究。方法将ZOL与氨基-聚乙二醇-巯基连接作为骨靶向配体,通过加成反应修饰在PDA包覆的MSN表面,得到药物载体MSN@PDA-PEG-ZOL,通过1H-NMR、FT-IR、TEM、粒径及Zeta电位等方法对其进行表征。以自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)为药物模型,设计不同药物浓度计算载药量及包封率,筛选最佳处方,并考察药物在不同环境下的释放量。结果制备得到的纳米颗粒为分散均匀的球形结构;粒径及Zeta电位分别为(229.1±8.8)nm、-(30.3±0.6)mV;载药浓度在1000μg·mL^(-1)时,其包封率为(90.87±0.05)%,载药量为(37.55±0.02)%。纳米颗粒在pH 7.4的PBS溶液中48 h内的药物释放率为(16.99±0.15)%,在pH 5.0的PBS溶液中的释放率为(65.11±1.64)%,有利于药物在肿瘤微环境中的释放。结论本文成功制备了负载3-MA且具有靶向性和pH响应性的纳米制剂,其分散性好,具有高载药量、高包封率等特点,可为后续研究奠定基础。

3-甲基腺嘌呤通过抑制AKT信号减轻糖尿病小鼠的早期肾损伤

目的探究3-甲基腺嘌呤(3-MA)减轻糖尿病早期肾损伤的机制。方法将24只小鼠随机分为对照组(CON组,n=8)和模型组(n=16)。模型组采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病,CON组注射等体积柠檬酸缓冲液。将造模成功的小鼠随机分为糖尿病组(DM组,n=8)和3-MA干预糖尿病组(DM+3-MA组,n=8),分别灌胃给予等体积生理盐水和3-MA 10 mg/(kg·d),每周记录小鼠体质量和空腹血糖,干预6周后取肾,记录肾/体质量比,PAS染色观察肾小球大小,Western blotting和免疫组化法检测肾皮质α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达。将SV40 MES 13细胞分别采用5.6 mmol/L正常糖(NG组)、5.6 mmol/L正常糖+24.4 mmol/L甘露醇(NG+M组)、30 mmol/L高糖(HG组)和30 mmol/L高糖加5 mmol/L 3-MA(HG+3-MA组)培养24 h,CCK8法检测细胞活力,Western blotting检测PCNA蛋白表达。对糖尿病肾脏疾病(DKD)基因靶点与3-MA预测基因靶点的交集基因进行生信分析,并外采用Western blotting对生信分析结果进行验证。结果体内实验结果显示,3-MA具有短期降血糖作用,可减轻糖尿病小鼠肾/体质量比和肾小球肥大(均P<0.05),减少糖尿病小鼠肾皮质α-SMA和PCNA蛋白表达(P<0.01,P<0.001)。体外实验结果显示,3-MA可显著抑制高糖处理的SV40 MES 13细胞活力和PCNA表达(均P<0.001)。生信分析结果显示,蛋白激酶B1(AKT1)为3-MA作用于DKD的关键基因,Western blotting结果显示,3-MA在体内外均可抑制AKT及核糖体蛋白S6(S6)的磷酸化。结论3-MA通过抑制AKT信号减少系膜细胞增殖减轻糖尿病早期肾损伤。

3-甲基腺嘌呤对转化生长因子-β诱导大鼠肝脏星形细胞株HSC-T6活化及自噬的影响观察

目的观察3-甲基腺嘌呤(3-MA)对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的大鼠肝星形细胞株HSC-T6活化及自噬的影响。方法取对数生长期的HSC-T6细胞分为空白组、TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组。TGF-β+3-MA组细胞加入浓度为2 ng/mL TGF-β培养72 h后加入3-MA(0.5 mg/mL)处理24 h,TGF-β+PBS组细胞加入浓度为2 ng/mL TGF-β培养72 h后加入等量PBS处理24 h,空白组加入等量PBS处理,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-βmRNA和自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5 mRNA,采用Western blotting法检测各组细胞活化标志物α-SMA、TGF-β蛋白和自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5蛋白。结果TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞活化标志物α-SMA、TGF-βmRNA和蛋白均高于空白组,且TGF-β+3-MA组均低于TGF-β+PBS组(P均<0.05)。TGF-β+PBS组、TGF-β+3-MA组细胞自噬标志物LC3、Beclin-1、Atg5 mRNA和蛋白均高于空白组,且TGF-β+3-MA组均低于TGF-β+PBS组(P均<0.05)。结论3-MA可抑制TGF-β诱导的大鼠肝星形细胞株HSC-T6活化及自噬。

3-甲基腺嘌呤通过抑制自噬和内质网应激途径保护睡眠紊乱诱导的大鼠肝损伤

目的:观察与分析3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对睡眠紊乱诱导的大鼠肝损伤的保护作用及其相应的机制。方法:将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和3-MA组,每组10只,对比各组大鼠实验前后体质量变化。处死大鼠后进行以下实验分析:(1)采用ELISA法检测各组大鼠血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)与天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平变化;(2)运用HE观察肝脏组织形态学的改变;(3)使用透射电子显微镜观察各组大鼠肝细胞中自噬体的形成;(4)采用TUNEL法评估各组肝细胞的凋亡水平,并计算凋亡指数;(5)通过RT-PCR与Western blot检测肝组织自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3-Ⅱ)、Beclin1、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)及Caspase-3的mRNA与蛋白表达水平。结果:动物实验结果表明睡眠紊乱会诱导大鼠肝损伤,同时伴随肝脏自噬与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)水平升高;相比对照组,模型组大鼠造模后体质量增量明显减小,而肝细胞形态结构变化明显,同时,血清ALT与AST水平、凋亡指数、自噬体数量及相关标志性蛋白表达水平均明显上升(P<0.05);相比模型组,肝细胞形态结构、血清ALT与AST水平、凋亡指数、自噬体数量及相关标志性蛋白表达水平均有改善(P<0.05)。结论:睡眠紊乱可诱导SD大鼠肝损伤,进而通过上调LC3-Ⅱ、Beclin1及GRP78蛋白表达和mRNA水平激活自噬与ERS信号通路,3-MA可拮抗自噬与ERS信号通路来保护肝细胞及抗凋亡作用。

3-甲基腺嘌呤对风湿性心脏病瓣膜纤维化的影响

目的 探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)对风湿性心脏病(RHD)瓣膜纤维化相关指标的影响。方法 取30只Lewis雌性大鼠,利用电脑随机数将大鼠分为正常组、模型组和实验组,每组10只。模型组和实验组通过后足垫、腹部皮下注射抗原Ⅰ、抗原Ⅱ造模,大鼠多处关节出现红肿,B超检查显示二尖瓣有不同程度反流,表明RHD模型建立成功。建模成功后,第8~9周,实验组大鼠于腹部皮下注射3-MA 2.5 mg/kg, 1次/周,模型组大鼠腹部皮下注射等量生理盐水;第10~24周,模型组、实验组大鼠腹部皮下注射0.5 mL抗原Ⅱ,1次/周,正常组大鼠在相同时间以同样方式注射等量生理盐水。采用免疫印迹(Western blot)法检测3组大鼠二尖瓣组织中PI3K、Akt、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、LC3Ⅱ及Ⅰ型胶原蛋白的相对表达量;采用ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)水平。结果 正常组、实验组、模型组大鼠的二尖瓣组织中PI3K、Akt、LC3Ⅱ的相对表达量依次升高,组间差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的相对表达量均高于正常组、实验组,差异均有统计学意义(均P<0.05);正常组与实验组的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。正常组、实验组、模型组大鼠的二尖瓣组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平依次升高,组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 3-MA能够有效抑制RHD大鼠二尖瓣组织自噬,减轻心脏瓣膜纤维化;调控PI3K/Akt信号通路可能是3-MA起抑制纤维化的作用机制之一;自噬作用的调控可能与TNF-α、IL-6及IL-8水平具有一定的相关性。

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响

目的探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组。对照组:仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:将ARPE-19细胞置于含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基中孵育12 h;3-MA组:使用含10 mmol·L^(-1)3-MA(美国Sigma-Aldrich公司)的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用正常DMEM-F12完全培养基孵育细胞12 h;3-MA联合A2E组:先使用10 mmol·L^(-1)3-MA预处理细胞1 h,再将细胞放入含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育12 h。使用CCK\|8法检测各组ARPE-19细胞增殖情况,透射电镜观察各组ARPE-19细胞超微结构,Western blot法检测各组ARPE-19细胞Beclin-1和P62自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色法检测各组ARPE-19细胞自噬标志物LC3蛋白的表达,使用Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液10种细胞因子表达情况,10种细胞因子包括:细胞间黏附分子、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL^(-1)0、血管生成素2、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子和VEGFA。结果与A2E组相比,3-MA联合A2E组细胞生存率下降了27.16%(P<0.01)。与A2E组相比,3-MA联合A2E组细胞培养上清液10种细胞因子含量均明显升高(均为P<0.01)。与对照组相比,3-MA组ARPE-19细胞超微结构无明显变化,而A2E组ARPE-19细胞胞浆内出现大量自噬泡;3-MA联合A2E组ARPE-19细胞自噬泡数量较A2E组明显减少。3-MA联合A2E组ARPE-19细胞胞浆内可见荧光斑点亮度较A2E组减弱,绿色荧光斑点数量也明显减少。与对照组相比,A2E组ARPE-19细胞Beclin-l蛋白相对表达量显著升高(P<0.001),P62蛋白的相对表达量显著降低(P<0.001)。与A2E组相比,3-MA联合A2E组ARPE-19细胞中Beclin-l蛋白相对表达量显著降低(P<0.01,),而P62蛋白相对表达量显著升高(P<0.001)。结论3-MA联合A2E作用下,ARPE-19细胞中炎症因子和血管生长因子的表达显著升高,自噬溶酶体数量及自噬蛋白的表达降低,自噬在年龄相关性黄斑变性的发生和发展中具有重要的调节作用。

3-甲基腺嘌呤对喜树碱诱导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的:本研究探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对喜树碱(Camptothecin,CPT)诱导的Hela细胞凋亡的影响。方法:用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT方法)检测CPT对Hela细胞作用的最佳药物浓度和时间,以及不同药物对Hela细胞增殖活性的影响;用免疫印迹及免疫荧光检测不同药物作用于Hela细胞后,Hela细胞自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62及凋亡相关蛋白的变化;DAPI核染色观察细胞凋亡。结果:CPT作用于Hela细胞后,Hela细胞增殖活性明显下降,并且可诱导自噬现象的发生。CPT和3-MA联合作用较单独CPT作用Hela细胞的增殖活性降低,细胞自噬水平下降,凋亡率明显升高。结论:CPT在诱导Hela细胞凋亡的同时可诱导自噬,通过3-MA抑制自噬可增强Hela细胞对CPT作用的敏感性。

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在H_2O_2引起的神经胶质瘤U251细胞损伤中的作用

目的:探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)在H_2O_2诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤过程中的作用。方法:实验分为4组:正常对照组、10mmol/L 3-MA组、1mmol/L H_2O_2组、1mmol/L H_2O_2+10mmol/L3-MA组。MTT法检测各组的U251细胞增殖率;MDC染色检测细胞自噬空泡的变化;Hoechst 33342染色检测细胞核染色质凝聚变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:与对照组相比,单独应用3-MA对U251细胞无明显影响。H_2O_2作用组U251细胞增殖率明显降低,细胞内出现自噬空泡,细胞核染色质凝聚,细胞凋亡率增加。3-MA与H_2O_2联合作用于U251细胞时,与单独应用H_2O_2组相比,抑制了H_2O_2引起的胞内自噬空泡的积聚,但细胞凋亡率明显增加。结论:自噬抑制剂3-MA能够-定程度地抑制H_2O_2诱导的U251细胞自噬,但促进了细胞凋亡,表明自噬在H_2O_2诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤过程中很可能起到保护性作用。

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肝星状细胞增殖活化的影响

目的观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,设立空白对照组和3-MA低剂量组(2.5 mmol/L)、中剂量组(5 mmol/L)、高剂量组(10 mmol/L)。RT-PCR分析不同浓度3-MA对HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响,Western blot法检测不同浓度3-MA对HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白表达水平的影响;MTT法检测3-MA对HSC增殖的影响,流式细胞术分析3-MA对HSC细胞周期的影响。结果低、中、高剂量3-MA作用于HSC后,HSC-T6细胞自噬水平随3-MA浓度升高逐渐下降,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量均明显低于对照组(P<0.05),LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白相对表达量均明显低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,低、中、高剂量时3-MA对HSC增殖的影响均显著下降(P<0.05),G2期比例与对照组比较均明显增加(P<0.05)。结论 3-MA可下调大鼠HSC-T6细胞LC3Ⅱ的表达,抑制α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA及蛋白的表达,使HSC-T6细胞周期停滞于G2期,抑制HSC增殖活化。

3-甲基腺嘌呤对顺铂诱导HeLa细胞凋亡的影响

目的采用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬,观察其对顺铂(DDP)诱导HeLa细胞凋亡的影响,探讨自噬在DDP诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡中的作用。方法用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察3-MA对DDP抑制HeLa细胞生长情况的影响;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;间接免疫荧光法检测自噬标志蛋白LC3和p62的变化;Hoechst荧光染色检测细胞凋亡。结果 MTT法显示,3-MA与DDP联合应用导致HeLa细胞生长抑制率增加;光镜结果显示,3-MA与DDP联合应用加剧了HeLa细胞收缩变圆,促进死亡;间接免疫荧光法检测到3-MA与DDP联合应用减弱了DDP诱导的HeLa细胞LC3聚集及其与p62的共定位;Hoechst荧光染色检测到3-MA与DDP联合应用增加HeLa细胞凋亡率。结论 3-MA抑制自噬能够促进DDP诱导HeLa细胞发生凋亡。

3-甲基腺嘌呤增强口腔鳞癌体外化疗药物敏感性的作用机制

目的:通过在口腔鳞癌Tca83细胞培养过程中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA),观察顺铂(DDP)对口腔鳞癌Tca83细胞的杀伤作用,探讨3-MA增强口腔鳞癌化疗药物敏感性的作用机制。方法:将对数生长期口腔鳞癌Tca83细胞分为对照组、3-MA处理组、DDP处理组、3-MA+DDP处理组和DDP+3-MA处理组,用MTT法检测细胞生存率,激光共聚焦显微镜检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:Tca83细胞株对顺铂IC50值为5mg.L-1;MTT检测,DDP组细胞生存率显著低于对照组和DDP+3-MA组(P<0.05),高于3-MA+DDP组(P<0.05);细胞免疫荧光检测,3-MA组平均荧光强度显著低于其他4组(P<0.05);流式细胞术检测,DDP组细胞凋亡率显著低于3-MA+DDP组(P<0.05),高于DDP+3-MA组(P<0.05)。结论:不同水平的自噬对口腔鳞癌细胞的作用不同,抑制细胞自身基础水平的自噬可增强DDP对Tca83细胞的杀伤作用,提示自噬抑制剂有望成为口腔鳞癌的化疗增敏剂。

3-甲基腺嘌呤预处理对大鼠多发性创伤后急性肺损伤的保护作用

目的：通过3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）对多发性创伤模型大鼠进行预处理,探讨自噬在多发性创伤后急性肺损伤中的作用。方法：4月龄成年雄性SD大鼠45只,体重250～300 g,按照随机数字表随机分为3组：假手术组,对照组及3-MA组。假手术组仅在颅骨相应位置钻孔;3-MA组及对照组均采用液压打击器及自制骨折打击器制备股骨干骨折合并脑损伤模型,且分别于造模前1 h 给予10 mg/kg的3-MA或等量生理盐水。各组大鼠于术后48 h分别采用实时荧光定量PCR检测肺部LC-3Ⅱ及Beclin-1的表达;ELISA法检测肺部炎症因子TNF-α、IL-6的浓度;HE染色观察肺部的组织病理学改变。结果：术后48 h,对照组大鼠肺部LC-3Ⅱ及Beclin-1的mRNA水平明显高于假手术组（P〈0.01）,而3-MA组上述基因的表达显着低于对照组（P〈0.01）;术后48 h,对照组大鼠肺部的TNF-α及IL-6浓度明显高于假手术组,3-MA组上述因子的浓度显着低于对照组（P〈0.01）.3-MA组大鼠肺组织病理评分显着低于对照组（P〈0.01）.3-MA组大鼠肺组织病理评分显着低于对照组（P〈0.01）.结论：自噬可以加重股骨干骨折合并脑损伤后的急性肺损伤,而采用其抑制剂3-MA进行预处理可以降低细胞自噬水平,进而减轻肺部的损害。

3-甲基腺嘌呤对低氧状态下上皮性卵巢癌细胞自噬、迁移和侵袭的影响

目的·检测3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对低氧状态下上皮性卵巢癌细胞(epithelial ovarian carcinoma,EOC)自噬、迁移和侵袭的影响。方法·不同浓度的3-MA处理低氧环境下EOC细胞,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3的表达,透射电子显微镜观察自噬体的生成,噻唑蓝比色法、黏附试验、Transwell迁移试验和Matrigel侵袭试验分别测定EOC细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力。结果·3-MA可以抑制低氧环境诱导的LC3-Ⅱ表达增加以及自噬体生成。低氧环境下,5.00 mmol/L的3-MA作用24 h可显著降低EOC细胞存活率(P=0.000);2.50 mmol/L的3-MA作用6 h后,细胞的黏附能力显著降低(P=0.007);1.25 mmol/L和2.50 mmol/L的3-MA均可抑制低氧环境下EOC细胞的迁移和侵袭能力(均P<0.01)。结论·3-MA在抑制低氧状态下EOC细胞自噬的同时,具有抗细胞迁移和侵袭的作用。

3-甲基腺嘌呤对急进高原缺氧大鼠肠上皮细胞损伤的自噬影响研究

目的探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对急进高原缺氧大鼠肠上皮细胞自噬水平及损伤程度的影响。方法将50只Wistar大鼠随机分成5组(A^E组),在低氧氧舱环境下建立急进高原缺氧大鼠肠上皮细胞损伤模型,用3-MA进行处理,肉眼观察各组大鼠的行为学改变,HE染色分析大鼠肠组织的损伤程度,免疫组织化学检测自噬相关蛋白LC-3、Beclin-1的表达情况,RT-PCR方法检测LC-3、Beclin-1 mRNA的表达情况。结果 3-MA作用于缺氧大鼠肠上皮细胞后,肠组织的病理性损伤明显加重,自噬相关蛋白LC-3、Beclin-1及其相关mRNA表达也显著降低,细胞自噬水平下降。结论 3-MA可能通过降低细胞自噬水平加重急进高原缺氧肠上皮细胞损伤,细胞自噬可能是急进高原缺氧肠上皮细胞损伤过程中的重要保护因素之一。

3-甲基腺嘌呤对人耐药大肠癌SW480细胞增殖及自噬活性的影响

目的 :研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对耐5-氟尿嘧啶(5-Fu)结肠癌SW480细胞增殖及自噬活性的影响,探讨自噬抑制剂在逆转结直肠癌耐药中的作用。方法:浓度递增筛选法诱导耐5-Fu(100μg/L)的SW480细胞株,用10μmol/L浓度的3-MA处理后,再用5-Fu(浓度200μg/L)作用24 h。采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,丹酰戊二胺(MDC)染色和电镜检测细胞自噬活性变化。结果:3-MA对耐药细胞自噬活性的抑制率达89.7%,增殖抑制率为9.6%,凋亡率为5.7%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。经3-MA处理后,5-Fu对耐药SW480细胞增殖抑制率达71.6%±2.9%,凋亡率达36.6%±2.9%,而单用5-Fu细胞增殖抑制率仅为23.6%±2.9%,凋亡率仅为10.3%±2.5%,3-MA预处理后5-Fu对耐药细胞的增殖抑制率及凋亡率均明显增强(P<0.05),自噬泡数量显著减少,自噬活性明显降低(P<0.05)。结论:3-MA单用时仅有较弱的抗肿瘤作用,与5-FU联用时耐药细胞的增殖及自噬活性被显著抑制,增强了SW480耐药细胞对5-Fu的敏感性,提高了化疗效果。

3-甲基腺嘌呤对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响

目的:研究PI3K通路自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响。方法:不同浓度MG132处理A2870细胞后,MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的生存率及凋亡改变,吖啶橙(AO)染色和Western-Blot法检测酸性自噬泡的形成及自噬特异性蛋白LC3的变化。3-MA联合MG132处理A2870细胞,MTT法检测细胞的生存率,AO染色和Western blot法检测自噬的改变。结果:MG132可诱导A2870卵巢癌细胞发生增殖抑制及凋亡,同时,酸性自噬泡形成及LC3-I向LC3-Ⅱ的转化增强。而3-MA联合MG132明显降低A2870细胞的生存率,但不改变MG132诱导的A2870细胞的自噬水平。结论:3-MA对MG132抗A2870卵巢癌细胞的增强作用与自噬无关。MG132诱导A2870细胞发生的自噬与PI3K通路无关。

3-甲基腺嘌呤对顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡影响的研究

目的:探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对顺铂(DDP)诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响。方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞,用PI3K/Akt通路抑制剂3-MA预处理SKOV3细胞3h,再用DDP作用48h,经Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测凋亡率,TUNEL法检测凋亡指数(AI),Western blot检测凋亡蛋白caspase3,caspase9的表达。结果:3-MA预处理后,DDP诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡率为(37.04±7.15)%,凋亡指数为58.0±5.20,而单用DDP组凋亡率为(10.46±0.65)%,凋亡指数为26.0±3.46。3-MA预处理后,DDP诱导的SKOV3细胞凋亡率和凋亡指数均较单用DDP组明显提高(P<0.05)。caspase3,caspase9蛋白的表达也明显增强。结论:3-MA可上调caspase3,caspase9蛋白的表达,通过内源性途经增强DDP促卵巢癌细胞SKOV3的凋亡活性。

3-甲基腺嘌呤对EPCs超微结构和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响研究

目的探索3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)超微结构和自噬体膜型(LC3-Ⅱ)蛋白表达的影响。方法采用密度梯度法取大鼠骨髓EPCs,体外诱导分化并鉴定;分成对照组和4个3-MA浓度组(分别加入1.25、2.5、5、10mmol/L 3-MA)。采用单丹(磺)酰戊二胺(MDC)荧光染色和透射电镜观察3-MA给药后EPCs自噬的发生。Western blot检测3-MA给药后EPCs内LC3-Ⅱ蛋白表达的变化。结果 MDC荧光染色和透射电镜均观察到5、10 mmol/L组EPCs超微结构明显区别于正常及死亡细胞,是典型的凋亡形态图。Western blot检测3-MA给药24h后EPCs LC3-Ⅱ蛋白表达降低;与对照组比较,5、10 mmol/L组LC3-Ⅱ蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论 5、10mmol/L的3-MA对EPCs超微结构和LC3-Ⅱ蛋白表达均有影响,推测浓度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬。

3-甲基腺嘌呤调控自噬对大鼠内皮祖细胞促进静脉血栓再通的影响

目的观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)调控大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)自噬,探讨其对静脉血栓再通的影响。方法密度梯度法取大鼠骨髓EPCs,体外诱导分化并鉴定。建立大鼠静脉血栓模型。实验分为4组:单纯生理盐水组(对照组,A组)、单纯3-MA组(5mmol/L3-MA,B组)、单纯EPCs组(C组)和3-MA联合EPCs组(5mmol/L3-MA作用于EPCs24h,D组),每组各20只大鼠。在血栓形成后的10天经大鼠尾静脉注入各组试剂,再过14天取标本。苏木精-伊红染色(HE)及vWF免疫组化染色观察血栓机化再通情况,并在镜下计数各组毛细血管数目,取其平均值。结果 (1)D组经HE及免疫组化染色观察发现新生血管最多,与其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05);(2)C组分别与A组和B组比较,差异有统计学意义(P<0.05);(3)A组与B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 5mmol/L3-MA调控自噬后的EPCs经大鼠尾静脉注射可促进大鼠静脉血栓再通,且比单纯注射EPCs效果更好。