3-甲基腺苷对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响

目的:研究自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-methylaclenine,3-MA)对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响。方法:常规培养人乳腺癌T47D细胞,分为对照组、3-MA组、芹菜素组、3-MA+芹菜素组。MTT法检测各组的细胞增殖抑制率;GFP-LC3质粒转染观察各组细胞自噬情况;Hochest/Mito-Red/YO-PRO-1染色法观察各组细胞凋亡形态;Annexinv/PI双染法流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;western hlot法检测LC3及PARP的变化。结果:MTT示3-MA+芹菜素组的增殖抑制率明显高于其他各组(P<0.05);GFP-LC3质粒转染结果显示:对照组,3-MA组及3-MA+芹菜素组自噬不明显,而芹菜素组与其他各组相比自噬明显增多(P<0.05);3-MA+芹菜素组的凋亡细胞增多,各组凋亡率分别为(12.73±0.05)%,(18.46±0.03)%,(23.27±0.07)%,(34.14±0.05)%,与对照组相比有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,芹菜素组LC3-Ⅱ增高,而3-MA组及3-MA+芹菜素组的LC3-Ⅱ显著减少,3-MA+芹菜素组PARP的剪切带相比其他各组明显增加。结论:自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后,能够明显增强芹菜素对乳腺癌T47D细胞系的凋亡诱导效应。

METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用

背景:高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血症与胰岛β细胞功能密切相关,但其具体分子机制尚不完全明确。目的:探讨METTL3在Hcy诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用。方法:取第3,4代小鼠胰岛β细胞进行实验。①细胞模型建立和分组:对照组细胞不加入Hcy,Hcy组细胞加入浓度为100µmol/L Hcy干预48h;②按Lipofectamine^(TM) 2000说明书将过表达质粒Ad-METTL3及si-METTL3转染小鼠胰岛β细胞,设计3种不同干扰片段,PCR验证、筛选出干扰效率最好的干扰片段;③转染后实验分组:对照组、Hcy组、Ad-NC(阴性对照)+Hcy组、Ad-METTL3+Hcy组、si-NC(阴性对照)+Hcy组和si-METTL3+Hcy组;④采用qRT-PCR及Western blot检测细胞中METTL3及细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达;ELISA法测定胰岛素水平来评价胰岛β细胞胰岛素分泌能力;分别过表达和干扰METTL3后检测细胞自噬相关蛋白及胰岛素水平。结果与结论:①与对照组相比,Hcy组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平升高(P<0.05),而p62表达明显降低(P<0.05),胰岛素分泌能力明显下降(P<0.05);②与对照组相比,Hcy组中METTL3蛋白及mRNA水平表达均降低(P<0.05);③胰岛β细胞中沉默METTL3后,Hcy进一步上调了细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的表达(P<0.05),而p62表达显著下降(P<0.05),细胞中胰岛素水平增加(P<0.05);过表达METTL3后,Hcy则使LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低且p62表达则增高(P<0.05);④结论:METTL3参与了Hcy诱导的胰岛β细胞自噬调控,对胰岛素的分泌发挥着调控作用。

调节自噬提高人肝癌Bel-7402/FU细胞株对5-氟尿嘧啶的敏感性

目的:探讨细胞自噬对肝癌Bel-7402/FU细胞5-氟尿嘧啶敏感性的影响。方法:选取Bel-7402、Bel-7402/FU细胞株,分为对照组、5-氟尿嘧啶组、自噬抑制剂3-甲基腺苷组以及5-氟尿嘧啶+3-甲基腺苷组,MTT法了解抑制细胞自噬对肝癌5-氟尿嘧啶IC50值的影响;流式细胞术检测抑制细胞自噬对细胞凋亡的影响;GFP-LC3质粒转染观察细胞浆中GFP-LC3分布情况。结果:Bel-7402细胞株与Bel-7402/FU细胞株5-氟尿嘧啶IC50值分别为4.66、68.14μg/mL,凋亡率分别为13.80%、1.09%。3-甲基腺苷联合5-氟尿嘧啶作用后Bel-7402细胞株与Bel-7402/FU细胞株的氟尿嘧啶IC50值分别为4.31、29.44μg/mL,凋亡率分别为13.82%、6.86%。在3-甲基腺苷作用下,Bel-7402/5-FU细胞株5-氟尿嘧啶诱导的点状样GFP-LC3的细胞数量减少。结论:抑制细胞自噬可降低Bel-7402/FU对5-氟尿嘧啶IC50值,诱导细胞凋亡,从而有效地逆转Bel-7402/FU对5-氟尿嘧啶耐药。

N^6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷-3′-H-膦酸的合成工艺研究

目的研究N^6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷-3′-H-膦酸的合成工艺。方法以腺苷为起始原料,先对腺苷的嘌呤氨基进行苯甲酰基保护,再分别向腺苷的5′位和2′位引入二甲氧基三苯甲基(DMT)和叔丁基二甲基硅基(TBDMS)保护基,制备得到关键中间体N^6-苯甲酰基-5′-二甲氧基三苯甲氧基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷(3)。中间体3与磷试剂2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮反应引入膦酸基团,最后使用二氯乙酸脱除DMT保护基得到目标产物。结果经过5步反应得到了目标化合物N^6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷-3′-H-膦酸,并利用~1H-NMR、^(31)P-NMR、质谱等方法确证了其结构。本合成工艺的总收率为35.7%,目标化合物的质量分数为98.5%。结论该合成工艺与原有方法相比步骤短,操作简单,具有良好的应用前景。

氯-IB-MECA合成的研究进展

2-氯-N6-(3-碘苄基)腺苷-5'-N-甲基尿嘧啶(氯-IB-MECA)是由Can-Fite公司开发的具有选择性的A_(3)腺苷受体激动剂,可同时治疗非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和肝细胞癌,具有广阔的市场前景。根据起始原料的不同对氯-IB-MECA合成方法进行了系统讨论。方法1以1-O-甲基-β-D-呋喃核糖苷为起始原料,经选择性羟基保护、氧化反应、酯化反应、酰胺化、酸化及脱保护得到氯-IB-MECA。方法2以2-乙酰氧基-5-((苯甲酰氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯为原料,经Vorbruggen糖苷化反应、亲核取代反应、保护基交换、氧化反应、羧酸酰胺化得到氯-IB-MECA。方法3以四乙酰核糖为原料,经亲核取代反应、脱乙酰基、邻二羟基保护、伯醇氧化、羧酸酰胺化和水解反应得到氯-IB-MECA。方法4以β-D-呋喃呋喃糖醛酸甲酯三乙酸酯为原料,经亲核取代、酯基酰胺化和脱乙酰基后得到氯-IB-MECA。经过比较认为,方法4原料易得,合成步骤少,反应和分离条件温和,收率高,更适合氯-IB-MECA的工业化生产。

抗坏血酸碳点通过促进自噬杀伤舌鳞癌细胞

目的:研究抗坏血酸碳点(ascorbic acid carbon dots,AACDs)对舌鳞癌细胞系Cal27的杀伤作用及其机制,为碳点在舌鳞癌治疗的应用奠定基础。方法:以Cal27为空白对照组,AACDs组、3-甲基腺苷(3-MA)组及AACDs+3-MA组为实验组,运用MTT法检测细胞增殖活性,吖啶橙(AO)染色法观察细胞自噬情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:MTT结果显示,AACDs能够抑制Cal27的增殖活性,并呈明显的剂量依赖性;AO染色结果显示,AACDs可以促进Cal27发生自噬,其中100 mg/L AACDs引发的自噬水平最高;加入3-MA降低AACDs引发的自噬水平后,细胞增殖活性水平升高,同时细胞凋亡水平降低。结论:AACDs通过促进自噬对Cal27发挥杀伤作用。