拟南芥和油菜3-磷酸甘油酰基转移酶的关键活性位点鉴定

【目的】3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)催化三酰甘油(TAG)生物合成途径中的第1步酰化反应,TAG合成能力是油料作物的关键性状,但亦与人类肥胖症密切相关,了解GPAT结构与功能的内在关系对于这一性状的遗传或化学遗传调控至关重要。本研究旨在鉴定调控植物GPAT活性的关键氨基酸位点。【方法】运用定点突变技术构建了58个GPAT9突变基因,结合GPAT特异的酵母遗传互补法,剖析单一和多个氨基酸位点改变对GPAT9酶活性的影响。【结果】通过对拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9和油菜Brassica napus BnGPAT9的19个氨基酸残基进行分析发现:AtGPAT9的N端6个磷酸化位点的单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性。相反,其他6个位于酰基转移酶保守结构域外的氨基酸残基(85、114、119、230、237、322位)的改变能够显著影响GPAT9酶活性。发现这些氨基酸残基之间存在交互作用,例如,3个位点同时突变(Y85W/N119H/S237N)能使AtGPAT9活性大幅上升,加速酵母的生长并促进TAG的合成,表达这一突变酶的酵母中的TAG含量比表达野生型BnGPAT9的增加了45.7%。更值得注意的是,在114和237位磷酸化氨基酸残基对酰基转移酶活性产生负面效应,暗示植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节。【结论】本研究获得了6个未经报道的关键GPAT酶活性调控位点,其中W85和H119是GPAT9正常功能所必需的,而L114、D230、N237和A322有利于维持GPAT9活性。

玉米甘油-3-磷酸酰基转移酶基因ZmGPAT13生物信息学及表达特性分析

【目的】对玉米(Zea mays L.)甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)家族成员ZmGPAT13进行生物信息学分析和在不同非生物胁迫处理下的基因表达模式变化检测,为进一步研究ZmGPAT13的生物学功能奠定理论基础。【方法】通过TAIR和MaizeGDB数据库获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)和玉米中GPAT家族蛋白序列,利用生物信息学方法进行理化性质、蛋白结构、亚细胞定位、保守基序、系统进化、磷酸化位点和启动子顺式作用元件等分析,并采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对ZmGPAT13在不同组织部位及甘露醇(Mannitol)、NaCl、脱落酸(ABA)、高温(42℃)、低温(4℃)处理下的相对基因表达量进行分析。【结果】ZmGPAT13是一个定位于线粒体的跨膜蛋白,与部分GPAT家族成员含有排序相同的15个保守基序(motif),且与拟南芥中AtGPAT1的亲缘关系最近;预测分析发现ZmGPAT13含有62个磷酸化位点,可能与玉米中多个GPATs存在相互作用关系;ZmGPAT13基因启动子富含多种与低温和ABA响应等相关的顺式作用元件。通过qRT-PCR技术对ZmGPAT13组织表达模式分析发现ZmGPAT13的相对基因表达量在胚芽鞘(Coleoptile)中最高,根(Root)中次之,叶片(Leaf)中最低;甘露醇(Mannitol)、NaCl、脱落酸(ABA)及高温(42℃)和低温(4℃)处理均能诱导ZmGPAT13的基因表达显著上调。【结论】玉米中ZmGPAT13具有高度的进化保守性,可能通过转录水平的变化参与调控玉米对干旱、盐、高温和低温等非生物胁迫的响应过程。

高温胁迫下转甜椒正义甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)烟草缓解PSⅡ光抑制

【目的】探讨类囊体膜脂组成与高温光抑制的关系。【方法】以转甜椒正义甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)的烟草植株为试验材料,测定了类囊体膜脂组成,高温胁迫后的光合参数和叶绿素荧光参数。【结果】转基因烟草植株类囊体膜的单半乳糖甘油二脂(MGDG),双半乳糖甘油二脂(DGDG),硫代异鼠李糖甘油二脂(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的饱和程度均上升,其中MGDG饱和程度增加了16.2%,上升幅度最为显著。随胁迫温度的升高,转基因烟草植株与野生型植株Fv/Fm,ΦPSⅡ和Pn逐渐下降,但转基因植株下降幅度小于野生型,48℃时差异最为显著。【结论】转基因烟草植株类囊体膜脂脂肪酸饱和度增加,提高了PSⅡ热稳定性,缓解了PSⅡ光抑制。

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPATs)的研究进展

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases,GPATs)催化甘油三酯和甘油磷脂合成的第一步反应。目前在哺乳动物已发现四种亚型GPAT1-4,其中GPAT1和GPAT2定位于线粒体外膜,而GPAT3和GPAT4定位于内质网。GPATs在调节细胞甘油三酯和磷脂含量中起着重要的作用。基因过表达和敲除实验证实GPATs在肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗和肥胖的发生发展过程中起着重要作用,并且部分亚型影响泌乳、精子发生等过程。本文将就GPATs各亚型的功能特点进行综述。

花生甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因的克隆及表达分析

本研究从花生中克隆得到2个GPAT基因,分别命名为AhGPAT3和AhGPAT5。AhGPAT3基因全长为1653bp,编码550个氨基酸;AhGPAT5基因全长为1383bp,编码460个氨基酸,均属于GPATs蛋白质家族。通过实时定量PCR检测克隆到的GPAT基因在花生不同组织、种子不同发育时期、多种非生物逆境胁迫及多种激素处理下的表达模式。结果显示,AhGPAT3与高等植物的GPAT3和GPAT2亲缘关系最近;AhGPAT5与高等植物的GPAT5和GPAT7亲缘关系最近。AhGPAT3和AhGPAT5基因在种子发育初期和下胚轴中的表达量较高;另外,发现AhGPAT3基因很可能参与了花生对低温、高盐和干旱的抗性调节。

麻疯树质体甘油-3-磷酸酰基转移酶(JcGPAT2)cDNA的克隆及序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT:EC2.3.1.15)是催化脂肪酰基转移到甘油-3-磷酸的Sn-1位上合成1-酰基-Sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂酸)的酶。通过设计兼并引物和RACE引物,克隆得到麻疯树质体JcGPAT2基因(GenBank登录号:FJ952147),其cDNA全长1 516 bp,其中编码区1 389 bp,编码462个氨基酸,与蓖麻等植物GPAT基因高度同源,且含有4个保守功能结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。表达分析表明,JcGPAT2在麻疯树各组织中为组成型表达,在胚中最高而茎中最低;在种子发育过程中,Ⅰ、Ⅱ期表达量较高,Ⅲ期表达量减弱后在IV期又显著增强;在冷处理麻疯树叶片中,其受冷诱导后表达量在处理4 h时显著增加,12 h后又逐渐降低。表明JcGPAT2在种子油脂合成和抗冷性反应中可能起到重要作用。

铁观音茶树甘油-3-磷酸酰基转移酶(CsGPAT)基因克隆及萎凋过程中的表达分析

【目的】以铁观音茶树鲜叶为试验材料,对参与甘油磷脂代谢途径的茶树甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,CsGPAT)进行克隆、生物信息学分析以及不同萎凋温度的表达量分析,了解GPAT基因在茶叶萎凋过程中的重要意义,以期为茶叶萎凋过程中温度调控提供理论基础。【方法】基于乌龙茶加工(萎凋)转录组数据,筛选获得茶树GPAT同源序列。利用ExPASy Protparam、SMART、SignalP 4.1Server、PSORT、prediction protein等在线软件进行生物信息学分析,利用SWISS-MODEL在线工具编辑GPAT蛋白质三维结构;在NCBI Blastp进行氨基酸序列同源比对。提取铁观音叶片RNA进行qRT-PCR,检测实时表达情况,克隆茶树GPAT基因全长。【结果】克隆得出CsGPAT(IDcsa:CSA000941.1/IDcss:TEA019813.1)基因序列全长1554 bp,编码497个氨基酸;GPAT蛋白属于稳定疏水性蛋白,不含信号肽,具有磷脂生物合成功能的PlsC域;进化树分析表明CsGPAT基因与油茶的亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果显示CsGPAT基因在20℃温度萎凋时表达量最高。【结论】CsGPAT基因在茶叶萎凋受到相对低温胁迫时,表达量上调,表明CsGPAT表达与茶叶萎凋过程中的温度调控密切相关。

冷诱导下毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性变化及其基因保守区的克隆

探讨了野生毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性在冷胁迫下的变化,用简并引物扩增了甘油-3-磷酸酰基转移酶基因保守区序列的结果表明,该保守区段长744 bp,推测编码247个氨基酸。在GPAT氨基酸序列中存在1个高度保守的区域(WIAPSGGRDRP),在NCBI上经过BLASTp比对分析,发现这段保守区序列为LPLAT基因超级家族酶类的催化活性区,此家族多为催化酰基辅酶A(acylCoAs)或者酰基载体蛋白(acylACPs)中的酰基与受体蛋白结合的酰基转移酶类。此序列Genbank登录号为HQ654523。

花生甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆与序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能及作用机理在模式植物拟南芥中已经得到了较为充分的研究,但是在花生中还没有关于这类基因的报道,其功能也没有得到证实。本研究通过Bioedit软件在花生cDNA文库中找到了6个可能编码GPAT蛋白的基因片段,其中有3个基因没有包含完整的开放阅读框。我们通过5'-和3'-RACE RT-PCR对这3个基因的全长进行了克隆,得到了包含完整读码框的基因序列,并将序列在GenBank上注册,同时对得到的序列进行了初步分析。

兵豆甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆和序列分析及蛋白质二级结构的预测

克隆了云南强抗冷性植物兵豆 (Lensculinaris)GPAT基因的编码区完整的cDNA片段 ,该片段长 1374bp ,编码 4 5 7个氨基酸残基。与豌豆 (Pisumsativum)、蚕豆 (Viciafaba)和长柔毛野豌豆 (Viciavillosa)相比较 (从剪切点起 ) ,氨基酸序列的同源性分别为 96 2 1%、95 6 6 %和 95 6 6 %。应用PSIPREDHFORMAT预测了这 4种植物GPAT酶的二级结构。

花生3-磷酸甘油酰基转移酶基因的功能鉴定

花生(Arachis hypogaea)是我国的主要油料作物,花生油脂的合成受3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)调控,但其调控机制尚不清楚。从花生中克隆了13个GPAT基因,编码含有4个酰基转移酶保守结构域的蛋白;同时,运用酵母遗传互补体系对基因功能进行了鉴定。在该体系中,酵母双突变体菌株ZAFU1(Δgat1/Δgat2)因缺少GPAT而不能在特定的葡萄糖培养基上生长。结果表明,AhGPAT1/2/3/6/9与空白载体一样,其导入并不能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,而AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的导入能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,说明上述3个基因具有酰基转移酶活性,从而为进一步研究花生油脂的合成代谢调控提供了参考。

羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

以羽衣甘蓝品种白孔雀为试验材料,通过同源克隆和RACE方法从低温诱导的羽衣甘蓝幼苗中分离得到了羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)基因的全基因序列,采用生物学软件对该序列进行生物信息学分析。结果表明:该基因全长1558bp,推测其编码451个氨基酸,并命名为BaGPAT。序列分析发现,羽衣甘蓝BaGPAT基因推导的氨基酸与已知其他植物GPAT基因序列有54%～85%的相似性。聚类分析结果显示:羽衣甘蓝GPAT(BaGPAT)基因与拟南芥和宽叶独行菜GPAT基因亲缘关系较近。

毛竹甘油3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因家族成员的生物信息学分析

以已知拟南芥、水稻的GPAT基因信息为基础,利用毛竹(Phyllostachys pubescens)基因组数据库分析了GPAT基因在毛竹中编码的相关酶类,确定了毛竹基因组中含有16个毛竹GPAT基因,并分析了这些基因的核苷酸序列长度、编码氨基酸的数量、蛋白分子量、基因结构和氨基酸序列保守结构域。

氨甲酰化诱导的牛晶状体3-磷酸甘油醛脱氢酶和硫醇转移酶的失活(英文)

目的:3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解过程中的一个关键酶,与老化和白内障发生密切相关,硫醇转移酶(TTase)可断裂晶状体蛋白质氧化形成的二硫键使硫醇化的蛋白质脱硫醇,对于维持晶状体透明性极为重要。氨甲酰化为重要的翻译后修饰。本研究观察氨甲酰化是否能诱导晶状体GAPDH和TTase的失活。方法:透明新鲜的晶状体取自2周岁健康牛,与100mmol/L氰酸钾于37℃水孵箱分别振动温育7d和12d。设透明晶状体为正常对照组。所有晶状体孵育在50mmol/LDMEM液中,然后每只晶状体去囊膜,匀浆,提取水溶性蛋白质。用分光光度计分别测量GAPDH和TTase的活性。结果:与氰酸钾孵育后GAPDH的活性与正常对照组相比显著降低(P<0.01),其中12d组与7d组相比,活性明显下降。TTase的活性在孵育7d后与对照组相比有统计学差异(P<0.05),12d组的活性与对照组相比有显著差异(P<0.01),7d组活性与12d组相比无统计学差异(P=0.19296)。结论:研究结果显示,分别与100mmol/L氰酸钾孵育7d和12d后,氨甲酰化组的GAPDH和TTase活性与对照组相比有统计学差异,证实氨甲酰化可以诱导GAPDH和TTase酶的失活,为TTase和GAPDH在白内障发病机制中的进一步研究提供了新思路。

长柔毛野豌豆编码甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

甘油 - 3-磷酸酰基转移酶 (GPAT)基因与植物抗冷性密切相关。克隆到的长柔毛野豌豆 (Viciavillosa)GPAT基因的编码区完整的cDNA片段长 1377bp ,编码 4 5 8个氨基酸残基 ,与蚕豆 (Viciafaba)和豌豆 (Pissumsativum)比较 ,其核苷酸序列的同源性分别为 94 1%和93 3% ,氨基酸序列的同源性分别为 96 9%和 98 0 %。

半乳糖-3-O-磺酰基转移酶-2与肿瘤转移关系的研究

半乳糖-3-O-磺酰基转移酶-2(GP3ST)是一个新近克隆的磺酰基转移酶,其生物学功能还不明确.GP3ST在肿瘤细胞和肿瘤组织中差异性表达,以及催化所形成的磺酰化糖链与肿瘤转移潜能密切相关,是首次研究报道.在高转移潜能的肿瘤细胞中,GP3ST及其产物的表达明显高于低转移潜能的细胞,在伴有淋巴结转移的喉癌组织中,GP3ST的高表达率也明显高于无淋巴结转移的喉癌组织(P<0.05),而且在喉癌组织中的表达也明显高于相对应的癌周组织.利用RNAi技术下调肝癌细胞SMMC7721中GP3ST的表达,观察到稳定转染RNAi/GP3ST的细胞形态发生明显的改变,由多边形转变为近似梭形,与TNF-α刺激后的HUVEC和sL-选凝蛋白的黏附能力下降.进一步研究表明,GP3ST表达的下降能抑制细胞中的整合蛋白αV亚基的表达,而β3亚基表达无改变,同时在高转移细胞株中αV的表达也明显高于低转移细胞株,与GP3ST表达的差异性相一致.上述结果充分说明GP3ST催化合成的糖链可通过调节肿瘤细胞的黏附性和影响整合蛋白αV亚基的表达参与肿瘤转移.

渥曼青霉素阻断罗格列酮对人巨噬细胞酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶-1表达的影响

目的:研究过氧化体增殖物激活型受体-γ(peroxisome proliferator activated receptors-γ,PPAR-γ)配体罗格列酮对巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase-1,ACAT-1)表达的影响及可能机制。方法:在RPMI 1640培养基中培养人单核细胞株(THP-1),加入佛波酯培养48h,细胞贴壁呈巨噬细胞样分化。将细胞分为空白对照组、不同浓度罗格列酮组和罗格列酮+渥曼青霉素(wortmannin)组,运用实时定量PCR和Western blot,观察巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:罗格列酮可明显抑制ACAT-1 mRNA和蛋白的表达,且呈浓度依赖性;加入磷酯酰肌醇三磷酸激酶(phosphate dylinositol 3-kinase,PI3K)信号途径抑制剂渥曼青霉素后ACAT-1表达较罗格列酮组高,较空白对照组低。结论:PPAR-γ配体罗格列酮通过PI3K途径抑制ACAT-1表达发挥其抗动脉粥样硬化的作用。

百合甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因密码子偏性分析及其表达受体选择

本研究运用CodonW和Emboss中的CHIPS、CUSP软件程序对铁炮百合(Lilium longiflorum)、亚洲百合杂种系品种(Lilium‘Excite’)、王百合(Lilium regale)和毛百合(Lilium pensylvanicum)这4种百合GPAT基因(GenBank登录号分别为:JX524738,JX524739,JX524740和JX524741)密码子进行偏好性分析,分别与5种单子叶和6种双子叶植物的GPAT基因密码子偏好性进行比较与系统进化分析,又与4种常用模式生物基因组密码子的偏好性进行比较分析。结果表明,4种百合GPAT基因密码子偏性均较弱,基因表达水平较低,偏好于以A/T结尾的密码子;偏好密码子基本相同。在一定程度上表明,百合的GPAT基因在属间进化中比较保守。并且发现,GPAT密码子偏好性在单、双子叶植物上体现的差异并不显著,从一定程度上表明GPAT基因在进化上的保守性较高。百合GPAT基因密码子偏性与几种双子叶植物的更相近,某些双子叶植物也是该基因的适宜导入受体。在系统进化分析中,基于相对同义密码子使用度(RSCU)的聚类结果与基于CDS构成的聚类结果存在一定的差异,但均可在一定程度上反映物种间的进化关系。与4种模式生物密码子使用频率比较发现,4种百合与受体生物的差异情况比较一致,百合GPAT的密码子偏好性与受体生物酵母和大肠杆菌的基因组密码子偏好性均有较大的不同,表明需要对百合GPAT基因的部分密码子进行优化改造,才能使其在以上受体中高效的表达。百合GPAT与拟南芥基因组密码子使用频率差值较少,表明百合GPAT在拟南芥受体中的表达效率较高;而百合GPAT在烟草受体中的表达效率一般。对于转化植物的选择,拟南芥优于烟草。为准确预测百合GPAT基因的异源表达,为接下来选择其适宜的表达系统以及提高该基因在受体表达系统中的表达效率,进行有效的功能验证提供了有效的参考。

叶绿体G 3 PAT酶酰基选择性与植物低温敏感性关系的研究进展

叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶(G 3 PAT)的酰基选择性与植物低温敏感性密切相关。一般来讲,冷敏感植物叶片中PG分子饱和度比抗冷植物中的高。叶绿体G3 PAT酶是决定PG分子种类并影响其分子中脂肪酸饱和度的关键酶,而G 3 PAT酶分子中的关键氨基酸影响了G 3 PAT酶的酰基选择性。

沉默赖氨酸乙酰基转移酶基因对人甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨赖氨酸乙酰基转移酶(Kat5)对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)信号通路的作用,阐明Kat5在甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡中的可能作用机制。方法:RT-PCR和Western blotting法检测甲状腺乳头状癌BHP10-3、TPC-1、K1细胞和甲状腺上皮Nthy-ori3-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平。将对数生长期甲状腺乳头状癌TPC-1细胞分为空白对照组、阴性对照组和沉默Kat5组(si-Kat5组)。空白对照组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞不转染,阴性对照组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞转染阴性对照siRNA,si-Kat5组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞转染Kat5 siRNA。RT-PCR和Western blotting法检测各组甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测各组TPC-1细胞增殖活性,克隆形成实验检测各组TPC-1细胞克隆形成率,流式细胞术检测各组TPC-1细胞凋亡率,Western blotting法检测各组TPC-1细胞中周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、P21、P53、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白水平。结果:甲状腺乳头状癌BHP10-3、TPC-1和K1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平均高于甲状腺上皮Nthy-ori3-1细胞(P<0.05)。各组TPC-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白水平、细胞增殖活性、细胞克隆形成率、细胞凋亡率以及细胞中CDK2、P21、P53、cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05);与空白对照组和阴性对照组比较,si-Kat5组TPC-1细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),细胞增殖活性降低(P<0.05),细胞克隆形成率降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中CDK2、p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平降低(P<0.05),P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:甲状腺乳头状癌细胞中Kat5 mRNA和蛋白表达水平升高,沉默Kat5基因可抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与其抑制PI3K/AKT信号通路有关。