白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶抗体的检测

目的:探讨白色念珠菌感染的患者中血清3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体的检测及临床意义。方法:将先前制备的GAPDH蛋白进行纯化并测定蛋白浓度,应用纯化后的蛋白包被96孔板。将临床初步诊断为白念感染,并经实验室唾液培养法检测出白色念珠菌的患者31例,正常人对照10例。采取血清样本,用ELISA法检测GAPDH抗体。结果:病人组的OD值为1.27832±0.227217,对照组的OD值为0.98143±0.094286,病人组明显高于对照组(P<0.05)。结论:GAPDH蛋白在体内是高表达,是患者体内的一种保护性抗体。

3-磷酸甘油醛脱氢酶在TRAIL诱导甲状腺癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phophoate de-hydrogenase,GAPDH)是否参与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosis factor related apoptosis indu-cing ligand,TRAIL)诱导的甲状腺癌细胞凋亡。方法:光学显微镜、流式细胞仪、实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法、台盼蓝染色和共聚焦显微镜分别用于检测细胞生存状态、凋亡、GAPDH mRNA与蛋白表达、细胞活性和核内GAPDH免疫染色表达。结果:对照组和2 ng/mL TRAIL处理组细胞生长状态良好,而其他处理组较差。TRAIL诱导凋亡和GAPDHmRNA均呈剂量依赖性。20 ng/mLTRAIL处理的FRO细胞中,GAPDHmRNA显著增加始于2 h,8 h达平台;GAPDH蛋白核转移始于2 h,8和12 h更为显著;2 h时无细胞死亡;GAPDH核染阳性细胞显著增加始于4 h,12 h时可占大部分。结论:GAP-DH可能介入了TRAIL诱导的细胞凋亡。

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的构建周期型马来丝虫（Bm）半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）重组复合基因真核表达质粒，观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应。方法将重组质粒pGEM—T／BmCPI和pGEM—T／BmGAPDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切，构建真核重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH。将纯化的pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸（CpGODN）免疫BALB／c小鼠，并设PBS对照组及空质粒对照组，共免疫3次，每次间隔2周。采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平。统计学分析采用t检验。结果pcDNA3．1（＋）-BmcPI／BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后，从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因。免疫6周后，pcDNA3．1（＋）-BmCPI／CpG组和pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH／CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1．466±0．635和1．610±0．112，显著高于PBS组的1．004±0．019和pcDNA3．1（＋）-CpG组的1．078±0．129（t=64．438、45．318、42．749、34．314，均P〈0．05）。免疫4周后，pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH／CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3．1（＋）-CpG组（t=288．053、76．453，均P〈0．05），其中IFN-γ水平与pcDNA3．1（＋）-BmCPI／CpG组相比也有明显提高（t=129．642，P〈0．05）。结论pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达，并可有效诱导特异性细胞免疫应答。

周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂复合基因真核重组质粒的构建与表达

目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氰酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂（GAPDH/CPI）复合基因真核重组表达质粒,为研制复合多价疫苗奠定基础.方法 依据GenBank中BmGAPDH及BmCPI基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克降后,克隆至载体pGEM-T Easy中.取阳性重组质粒pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI以及真核重组表达载体分别双酶切,将酶切后的载体和目的 片段进行连接,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/BmGAPDH/BmCPI.将复合基因重组质粒瞬时转染人HeLa细胞后,进行RT-PCR验证,将表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析和鉴定.结果 分别克隆了pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI重组质粒,经酶切鉴定分别得到877、621 bp特异性片段,与预期值吻合.成功构建了复合基因重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）/BmGAPDH/BmCPI,酶切鉴定所产生的片段大小与预期吻合.复合基因真核重组表达质粒转染HeLa细胞后得到高水平表达,SDS-PAGE分析显示重组蛋白相对分子质量（Mr）约为54×103.结论 成功构建了周期型马来丝虫GAPDH/CPI复合基因重组表达质粒,并在哺乳动物细胞内得到正确表达.

基于mRNA稳定性推断死亡时间的研究

目的探讨大鼠死后不同时间肾、脾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA的表达对死亡时间(PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,分别于死后0,8,16,24,32,40,48h共7个时相点(n=4)解剖,利用荧光RT-PCR技术检测大鼠肾、脾GAPDHmRNA相对表达量的变化。结果在大鼠死后40h肾、32h脾内可检测出GAPDHmRNA,且其表达产物均呈规律性下降趋势(荧光强度逐渐变暗并最终消失)。结论检测大鼠死后不同时间肾、脾GAPDHmRNA的表达对PMI推断具有一定的应用价值。

高果糖大鼠血清TG、UA、血糖的动态变化规律及机制研究

目的:动态观察高果糖模型大鼠血清甘油三酯(TG)、尿酸(UA)、血糖(GLU)及全血3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性和肝脏基因表达的变化规律,并探讨其病理机制。方法:随机将SD大鼠分为对照组、果糖组和非诺贝特治疗组。对照组予普通大鼠饲料;果糖组给予高果糖饲料[5];菲诺贝特治疗组给予高果糖饲料,同时灌胃菲诺贝特100 mg.kg-1.d-1进行给药。对照组、果糖组灌胃等量蒸馏水。实验期间动态检测血清TG、UA、GLU;改进正向反应法测定全血GAPDH活性;Quanti Gene(QG)分析法测肝GAPDH mRNA转录水平。结果:与对照组比,果糖组7-28 d TG持续明显升高;14-28 d UA明显升高;GLU仅在28 d明显升高;GAPDH活性及基因表达7-28 d均明显降低。菲诺贝特治疗组仅在7 d见明显降TG作用;而对UA则有明显升高的作用;对GLU在28d有明显的降低作用;对GAPDH活性及基因表达仅在造模7 d时有明显升高作用;其余未见明显变化。结论:①高果糖造模初期TG明显升高,随造模时间延长相继伴发UA及GLU明显升高。②TG、UA、GLU升高可能与GAPDH活性及基因表达降低有关。③菲诺贝特在高TG时有明显降TG作用,对伴发高UA和高GLU时未见明显影响。④菲诺贝特降TG的作用机制可能与提高GAPDH活性和基因表达有关。

小鼠肝组织GAPDH mRNA降解与死亡时间关系

目的探讨小鼠在不同的死亡方式下肝组织管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)mRNA降解与死亡时间(postmortem interval,PMI)的关系。方法将60只NIH小鼠分别采用窒息法和断颈法处死,分别置于10℃和25℃温控系统内,利用两步法RT-PCR技术和核酸蛋白测定仪检测小鼠肝组织中GAPDH mRNA在死后0～48h的降解情况。结果在10℃温控系统内的小鼠死后0～48h及25℃温控系统内的小鼠死后0～36h肝组织均可检测到GAPDH mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势。结论小鼠死亡后肝组织GAPDH mRNA降解与PMI呈负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标。

GAPDH基因与神经变性疾病研究进展

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是一种经典的糖酵解蛋白,除了参与能量代谢,还涉及多种细胞生理功能。研究表明,GAPDH很可能通过诱导神经元凋亡参与了神经变性疾病的发生。GAPDH蛋白是神经元胞体内嗜酸性包涵体重要组成成分之一,并参与异常蛋白聚集体的形成。多个遗传连锁分析和关联研究证据亦提示GAPDH基因很可能是迟发型阿尔茨海默病等神经变性疾病的致病候选基因。本文对近年来国内外GAPDH基因与神经变性疾病关系的研究进展进行简要综述,为进一步探究复杂性神经变性疾病的遗传机制提供指导,也为神经变性疾病的诊治提供新思路和新途径。

双重实时荧光定量PCR检测人维生素D受体的方法学构建

目的 建立单管检测人维生素D受体（VDR）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应（dual real-time PCR）的方法。方法 以GAPDH基因为内参,采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物及Taq Man探针,进行PCR扩增检测VDR基因。将VDR及GAPDH扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒,作为定量检测基因表达的标准品,并用于分析该方法的灵敏度和重复性。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为VDR及GAPDH特异性片段;该方法检测VDR与GAPDH灵敏度达40拷贝/μL;线性范围为4.00×10~1~4.00×10~5拷贝/μL;决定系数R2分别为0.998、0.999;扩增效率E分别为96.10%、85.15%;批内变异系数（CV）分别为0.09%~1.21%、0.35%~0.88%;批间CV分别为0.17%~0.51%、0.51%~2.46%。结论 成功建立了单管检测人VDR及GAPDH的双重实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、可快速高通量检测VDR的相对表达量,有效缩短时间,减小实验误差。