家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因(Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD)。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5'端非翻译区序列(5'-UTR)、一个930bp的开放阅读框(ORF)和一个155bp的3'端非翻译区序列(3'-UTR);基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。

羟酰辅酶A脱氢酶在癌中作用机制的研究进展

脂肪酸代谢与癌的发生发展之间存在密切联系。羟酰辅酶A脱氢酶(HADH)作为脂肪酸β-氧化的关键酶,近年来被发现在多种癌中为抑癌因子,在急性髓系白血病等中为促癌因子。在癌细胞中,HADH除直接催化脂肪酸β-氧化外,还间接作用于PPAR、TNF-α、JAK-STAT3、PI3K/Akt、IFN-γ、MAPK与非经典Wnt等多种信号通路,影响癌细胞增殖与迁移。HADH作为不同种癌诊断、治疗和预后的潜在肿瘤标志物,具备较高临床应用价值。

1例2-甲基3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶缺陷症患儿的临床诊治

目的:通过对1例2-甲基3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶缺陷症患儿的临床表现及检查结果的分析,提高对此类疾病的认识,为该病的及时诊断和治疗提供依据。方法:采用回顾性方法对我院收治的这名患儿的临床症状和体征、实验室常规检查结果、血、尿串联质谱和气相质谱检查结果、X光胸片、彩超、头颅MR、脑电图以及诊疗情况进行回顾和分析。结果:患儿3岁,主要临床表现初期以腹泻、呕吐为主,后来出现嗜睡、意识障碍,气促、难以纠正的代谢性酸中毒等。头颅MRI显示双侧侧脑室轻度扩张,脑沟、脑裂稍增宽。脑电图检查结果为界线性幼儿期脑电图,额、中央区尖波数次发放。血串联质谱检查天冬氨酸等氨基酸升高,尿气相质谱2-甲基-3-羟基丁酸明显增高,但未发现甲基巴豆酰甘氨酸和2-甲基乙酰已酸的异常,基因检测结果为hadh2基因第4外显子p.R130C突变。结论:2-甲基3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶缺陷症极为罕见,对有不明原因的难于纠正的代谢性酸中毒、高氨血症、或不明原因的精神萎靡、意识障碍等神经系统症状患儿应警惕该病,可送血或尿标本进行串联质谱、气相质谱及基因分析,以便早期诊断及治疗。

3-羟酰基辅酶A脱氢酶在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的:克隆并在大肠杆菌中表达3-羟酰基辅酶A脱氢酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,HCDH)并制备其抗血清。方法:通过PCR方法扩增HCDH基因片段,经DNA测序证实后克隆到原核表达载体pMAL-P2X,重组质粒转化大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,经麦芽糖树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫獭兔,琼扩和ELISA检测抗血清的效价,Western blot检测其特异性。结果:PCR扩增得到786bp的目的片段,序列测定证实与GeneBank上登录的序列一致;成功构建了HCDH基因片段的原核表达载体;在详细探索表达条件的基础上,成功诱导HCDH的表达,并制备了相应的抗血清。结论:检测HCDH蛋白在表达水平上的变化及为HCDH基因表达调控的进一步研究奠定了基础。

促性腺激素释放激素类似物对大鼠睾丸间质细胞膜联蛋白5和3β-羟类固醇脱氢酶mRNA表达的影响

目的:观察促性腺激素释放激素(GnRH)类似物对大鼠睾丸间质细胞annexin 5和3β-HSD mRNA表达的影响。方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞48 h后,分别用不同终浓度的GnRH激动剂(GnRH-agonist,GnRHa)(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)和GnRH拮抗剂(GnRH-antagonists,GnRHant)(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L)处理细胞,提取细胞总RNA,反转录,设计特异性引物和Tagman探针,荧光定量PCR检测膜联蛋白5(annexin 5)和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)mRNA表达的改变。结果:荧光定量PCR结果显示,与未加GnRH类似物的对照组相比,当GnRHa的终浓度为10-5mol/L、10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA分别升高了38.89%和35.29%,均具有统计学意义(P<0.05);当GnRHa的浓度为10-5mol/L时,3β-HSD mRNA也显著升高了46.43%(P<0.01)。同样,与对照组相比,当GnRHant的浓度为10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA下降了45.45%(p<0.05),当GnRHant的浓度为10-6mol/L,10-7mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA也分别显著地降低了63.64%(P<0.01)和50%(P<0.05),其余各组与对照组相比,差异无统计学意义。结论:GnRH类似物能够调控大鼠睾丸间质细胞annexin5和3β-HSD mRNA表达,GnRH类似物可能与睾丸间质细胞上GnRH受体结合后,通过特定的生理机制,进而影响annexin5和3β-HSDmRNA表达,为揭示GnRH类似物调控间质细胞分泌睾酮的作用机制提供了一定的依据,其内在的机制还有待进一步研究。

睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

从土壤中分离睾酮假单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α hsd)基因 ,将扩增产物用NdeⅠ /BamHⅠ消化 ,切下目的基因片段克隆到质粒 pET 15b中构建重组pET 15b .将重组 pET 15b转化入E .coliDH5α中 ,经酶谱分析和测序 ,鉴定出正确的重组质粒 pET 15b .将重组pET 15b转化入宿主菌E .coliBL2 1(DE3) pLysS中 ,用硫代半乳糖苷 (IPTG)进行诱导表达 .提取细菌总蛋白质进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分析并测定酶活性 .粗提物中酶活性高达 2 4 5× 10 5U/L .利用重组蛋白中的 6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析 ,经一步金属螯合亲和层析纯化后 ,重组蛋白在SDS PAGE上呈现出均一的单一条带 ,回收率达 6 8% .活性和纯度均较高的目的蛋白 3α HSD的获得 。

调神益肾针法对更年期大鼠卵巢、肾上腺皮质中3β-羟类固醇脱氢酶的影响

目的:研究调神益肾针法对更年期大鼠卵巢、肾上腺中3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSDH)的影响。方法:建立自然的更年期大鼠模型,实验动物包括青年组、更年组、针刺组,采用细胞酶化学技术,辅以计算机图像分析,观测卵巢、肾上腺中阳性物质总面积、积分光度值。结果:更年组大鼠卵巢窦状卵泡及成熟黄体细胞中3β-HSDH含量或活性明显降低,间质腺及肾上腺皮质束状带、网状带细胞中该酶的含量或活性仍维持正常。经针刺干预后,上述部位该酶的含量或活性均有显著提高。结论调神益肾针法能增加卵巢、肾上腺中雌激素合成关键酶的含量或活性,这可能是针刺提升体内雌激素水平的物质基础之一。

3α-羟类固醇脱氢酶的表达、纯化和酶学性质研究

从土壤中分离睾酮丛毛单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α HSD)基因。以质粒pET 1 5b为载体 ,构建 3α HSD的原核表达系统。经IPTG诱导后 ,得到了具有酶活性的融合蛋白 ,细菌总蛋白的表达量为 0 73g L ,其中融合酶蛋白占 1 6 4 % ,活性达 1 38× 1 0 5U L。利用融合蛋白N末端的His tag,经金属螯合亲和层析纯化后 ,得到了纯度较高的融合酶蛋白 ,酶蛋白的得率为 6 8% ,比活性为 1 94 7U mg。凝血酶切除His tag后 ,经质谱鉴定 ,重组蛋白的分子量为 2 6 5kD ,与理论推测值基本相同。 2 5℃以雄酮为底物 ,以NAD+ 和thio NAD+ 为辅因子时 ,融合蛋白参与酶促反应的最适pH分别为 1 0 5和 9 4。 37℃条件下酶促反应较快 ,2 5℃时的反应速度只有 37℃时的 5 2 % ,Q1 0 ( 2 5℃～ 35℃ ) 为 1 7。 2 5℃、pH1 0 5、以雄酮和各级胆汁酸为底物、NAD+ 为辅因子时 ,融合酶蛋白的动力学常数Km位于 4 2～ 5 1 1 μmol L范围内。融合酶蛋白发挥催化作用并不需要金属离子的参与 ,而Fe3+ 、Fe2 + 、Zn2 + 则抑制酶活性 ,反应体系中加入EDTA也并不影响酶的活性。活性和纯度均较高的融合蛋白 3α HSD的获得及其生物学性质的研究 。

慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110菌株3-羟丁酸脱氢酶基因(bdhA)的克隆、序列及特性

通过功能互补试验 ,从慢生型大豆根瘤菌USDA110菌株基因文库中筛选到能互补广宿主根瘤菌NGR2 34的bdhA突变体菌株NGRPA2和苜蓿根瘤菌的bdhA突变体菌株Rm1110 7、使之恢复Hbu+ 表型的克隆 ;经酶活测定和Southern杂交证明该克隆含有bdhA基因。测定了bdhA基因全序列 ,并在GenBank登记 (登记号为 :AY0 775 81)。该基因由 789个碱基对组成 ,编码分子量为 2 7.5 9ku、含 2 6 2个氨基酸残基的 3 羟基丁酸脱氢酶。在该基因的开放阅读框内插入interposonΩKm ,并通过同源重组构建了BradyrhizobiumjaponicumbdhA突变体 (bdhA ::ΩKm)。植株试验未显示bdhA基因的突变对结瘤、固氮有明显影响。

睾丸酮丛毛单胞菌的分离和鉴定及3α-羟类固醇脱氢酶在大肠杆菌中的克隆表达

目的:从自然界中分离鉴定产 3α 羟类固醇脱氢酶(3α hydroxysteroiddehydrogenase, 3α HSD)的睾丸酮丛毛单胞菌,并在大肠杆菌(E.coli.)中克隆表达 3α HSD。方法:将池塘泥浆样品接种到以雄酮为唯一碳源的培养基中,对分离到的菌株根据形态学和生理生化特征进行初步鉴定。为进一步鉴定该菌株,根据睾丸酮丛毛单胞菌中的 3α HSD的基因设计引物,PCR扩增细菌基因组DNA,将扩增片段插入到载体pET15b中,构建重组质粒pET15b,并在E.coli. BL21 (DE3 )pLysS中进行诱导表达,对表达得到的蛋白进行鉴定并测定其酶活力。结果:一系列生化反应和培养特征证实,该菌与睾丸酮丛毛单胞菌的符合率为 85%,最适生长pH值为 7. 0,最佳生长温度为 30℃。在E.coli. BL21 (DE3 )pLysS中经诱导表达得到了相对分子质量约为 29×103具有酶活性的融合蛋白,可催化雄酮(3α 羟类固醇)脱氢。结论:从池塘泥浆中分离到一株产 3α HSD的睾丸酮丛毛单胞菌,并在E.coli.中表达得到了具有酶活性的融合 3α HSD。这为利用金属螯和亲和层析纯化融合 3α HSD,并进一步建立以其为工具酶的血清总胆汁酸酶循环测定方法奠定了基础。

血清25-羟维生素D-3及谷氨酸脱氢酶在肝细胞癌中的表达及意义

目的分析血清25-羟维生素D-3(25(OH)D3)及谷氨酸脱氢酶(GLDH)在肝细胞癌(HCC)中的表达及意义。方法选择80例2015年6月-2017年6月在本院经组织病理学确诊为初诊HCC患者为观察组和80例本院健康体检者作为对照组,采集静脉血进行血清25(OH)D3及GLDH水平检测,比较两组对象各检测指标的差异,绘制ROC曲线分析各检测指标对HCC的诊断价值,Pearson相关性分析进行HCC患者血清25(OH)D3及GLDH水平间的关联分析。结果与对照组比较,观察组血清25(OH)D3明显降低、GLDH的水平明显增高,组间比较具有统计学意义(P<0.05);HCC分期越高,患者血清25(OH)D3水平越低,而血清GLDH水平越高,数据具有统计学意义(P<0.05);ROC曲线分析结果显示:25(OH)D3和GLDH对HCC的诊断AUC面积分别是0.814和0.806,诊断敏感性分别为81.30%和83.80%,诊断特异性分别为78.12%和80.53%,血清中25(OH)D3和GLDH的水平对HCC具备一定的诊断价值;Pearson直线相关性分析结果显示:HCC患者血清25(OH)D3和GLDH水平呈负相关(r=-0.457,P<0.05)。结论血清25(OH)D3和GLDH与HCC的发生发展存在紧密联系,对疾病的诊断、分子靶向治疗及预后的判断具有重要意义。

杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子驱动氯霉素乙酰转移酶基因的表达及其活性检测

目的为建立稳定高效的盐藻生物反应器寻找合适的内源性启动子驱动表达外源基因。方法克隆鉴定了盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因5'上游区序列并成功构建由盐藻GAPDH基因启动子驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达载体pUC-Gcat。利用构建的表达载体电击转化盐藻并在含有氯霉素的培养基中筛选转化藻株。随机挑选稳定转化的盐藻藻株进行CAT酶联免疫吸附测定分析。结果获得3株稳定转化的盐藻藻株。聚合酶链式反应鉴定和CAT酶联免疫吸附测定分析结果表明,CAT基因已整合到了转化的盐藻基因组中。结论本研究所克隆的内源性盐藻GAPDH基因启动子能够驱动CAT基因在盐藻中表达。

L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-羟-甾体脱氢酶活性的影响

目的 :研究L 酪氨酸对离体培养大鼠黄体细胞 3β HSD活性的影响。 方法 :运用细胞培养技术和放射免疫分析法 ,观察不同剂量L 酪氨酸对大鼠黄体细胞 3β HSD活性的影响和L 酪氨酸及其类似物酪氨酰肼在拮抗hCG诱导孕酮生成作用中 ,3β HSD活性的变化。 结果 :① 0 .2mmol-1和 2 .0mmol-1的L 酪氨酸明显抑制 3β HSD的活性 ,相同浓度的L 苯丙氨酸及L 多巴胺对此酶活性无影响 ;②在底物浓度较低时 ,L 酪氨酸可显著增强 3β HSD活性 ,随着底物浓度的增加 ,L 酪氨酸的作用逐渐减弱并转为抑制作用。③L 酪氨酸及酪氨酰肼对hCG诱导的 3β HSD活性有明显的抑制作用。结论 :L 酪氨酸可明显影响大鼠黄体细胞 3β HSD活性 ,其作用性质与底物浓度密切相关。L 酪氨酸及酪氨酰肼抑制hCG诱导的 3β HSD活性。

新生儿2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症26例临床分析

目的:分析新生儿2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症(2-MBAD)的基因型及临床特征。方法:选取2015年12月-2020年12月怀化市出生且接受疾病筛查的新生儿147947例为研究对象,分析2-MBAD发生率,2-MBAD患儿的基因类型、临床特征。结果:经串联质谱(MS/MS)筛查并结合基因检测诊断为2-MBAD的新生儿26例(1/5690),其中汉族10例,侗族8例,苗族7例,瑶族1例。发现短链或支链酰基辅酶A脱氢酶基因c.1165A>G 15个纯合突变位点,6种突变类型:3种为已报道突变(c.1165A>G、c.655G>A、c.923G>A);3种临床意义未明突变(c.1164G>C、c.1106T>A、c.848A>G);c.1165A>G是最常见基因型。未见民族、表型、基因型相关性。随访2~52个月,9例患儿出现发育迟缓。结论:确诊年龄越早、干预及时对患儿的精神运动发育情况影响越轻。

3α-羟类固醇脱氢酶的亲和纯化及化学修饰提高酶稳定性

研究了3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)经化学修饰后的稳定性变化。已构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-hsd经诱导表达、镍柱亲和纯化得到电泳纯的3α-HSD酶,酶蛋白得率是16.5%,活性回收率为64.7%,纯化倍数约为3.8,15%SDS-PAGE结果显示3α-HSD酶为单一条带,相对分子质量在28 000左右。采用邻苯二甲酸酐(PA)作为修饰剂,对3α-HSD纯酶进行化学修饰,与对照组相比,修饰酶抵抗p H波动的能力有所增强,50℃水浴10 min后酶的热稳定性明显提高,37℃贮藏40 h后修饰酶的贮藏稳定性比原酶提高9倍。

全合成3α-羟类固醇脱氢酶基因密码子优化及酶性质研究

以NCBI报道的Comamonas testosteroni ATCC11996中3α-羟类固醇脱氢酶基因(3α-hydroxysteroid dehydrogenase gene,3α-hsd,AF092031.2)为模板,通过改变碱基序列但不影响酶的氨基酸序列,将该基因相对于大肠杆菌的密码子适用指数由0.78提高到0.87,GC含量由原来的63.17降低到56.46,大幅度减少了GC簇及寡聚A和T局域的存在,提高3α—hsd的可表达性。全合成基因定向克隆到pET28a载体中,并转化至大肠杆菌B121(DE3)中表达。采用乳糖诱导后,SDS—PAGE检测在约27 kD处有一高效表达的蛋白条带。采用Ni螯合柱分离纯化3α-HSD,获得了较高纯度及较高的产率。酶学性质初步分析表明,全基因合成表达的3α-HSD的性质与原始的3α-HSD基本相同。

2-甲基丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症患者ACADSB基因变异分析

目的分析2-甲基丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症(2-MBAD)患者的基因变异特点,明确其致病原因。方法采集2018—2020年就诊于泸州市妇幼保健院的3例串联质谱发现异戊酰基肉碱(C5)升高疑似2-MBAD患者及其父母外周血并提取基因组DNA,应用高通量测序技术对患者进行遗传代谢性疾病基因检测,对疑似致病变异位点,父母进行Sanger测序验证。结果高通量测序结果显示:病例1,ACADSB基因外显子5,c.655G>A(p.V219M)(纯合变异);病例2,ACADSB基因外显子10,c.1165 A>G(p.M389V)(纯合变异);病例3,ACADSB基因外显子5,c.655G>A(p.V219M)(杂合变异),外显子10,c.1165 A>G(p.M389V)(杂合变异),生物信息学分析预测为致病性。Sanger测序验证结果显示,3例患者父母的外周血DNA中均发现相应的杂合变异。结论 ACADSB基因变异可能为2-MBAD患者的致病原因,新变异的检出丰富了基因变异谱,为家系的遗传咨询提供了依据。

1例3β-羟类固醇脱氢酶缺乏症临床特点及基因突变结果分析

为探索3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)缺乏症患儿的临床特点和基因突变特点,为临床诊治提供思路,本文对1例在广州市妇女儿童医疗中心遗传与内分泌科门诊就诊的3β-HSD缺乏症患儿的临床特点、激素水平检测结果及基因突变进行分析,并复习相关文献。本例患儿因皮肤色素沉着,阴蒂肥大就诊。B超显示子宫、卵巢组织。染色体核型为46XX。激素水平显示血促肾上腺皮质激素(ACTH)水平升高,血皮质醇(F)水平下降,硫酸脱氢表雄酮(DHEAs)水平增高,HSD3B2基因纯合错义突变,为第228位氨基酸由缬氨酸变为甲硫氨酸。3β-HSD缺乏症患儿可表现有失盐型及男性化型,与其他类型的先天性肾上腺皮质增生症不容易鉴别,△5类固醇增高及△5/△4类固醇比例增高提示3β-HSD缺乏症的可能,基因检测可进一步确诊。

17β-羟类固醇脱氢酶3型缺乏症1例并文献复习

目的探讨17β-羟类固醇脱氢酶3型缺乏症的临床特征与诊疗方法。方法通过分析2021年6月在山西医科大学第一医院就诊的1例17β-羟类固醇脱氢酶3型缺乏症患者的诊疗过程,并复习相关文献,探讨其发病机制及临床应对方法。结果该患者社会性别为女性,12岁逐渐发育出现男性特征,影像学显示双侧腹股沟隐睾且无子宫及卵巢。激素测定显示睾酮较低而雄烯二酮较高,且两者比值<0.8。染色体核型为46,XY。基因检测证实HSD17B3基因存在2号外显子c.179T>C纯合突变。结论17β-羟类固醇脱氢酶3型缺乏症非常罕见且误诊率较高,当怀疑该症时,首先应行内分泌评估(人绒膜促性腺激素激发实验尤为重要)与相应影像学检查,基因检测可进一步帮助明确诊断。