高效液相色谱法测定3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂的活性

通过检测反应体系中烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)浓度的变化,建立了测定HMG-CoA还原酶抑制剂活性的HPLC法。使用Hypersil C18色谱柱,流动相V(K2HPO4-KH2PO4):V(甲醇)=4:1,pH7.2,流速1mL/min,柱温25℃,检测波长337nm。在NADPH浓度为0.5～100μmol/L时,其浓度与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9995);检出限为0.01μmol/L;方法对NADPH的回收率为99.8%～100.7%;相对标准偏差(RSD)为1.04%～1.25%(n=5)。

ΔNp63上调3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶表达促进食管鳞状细胞癌细胞增殖及迁移

目的探讨N端转录活性域缺失的肿瘤蛋白p63(ΔNp63)调控食管鳞状细胞癌细胞增殖及迁移的分子机制。方法以人食管鳞状细胞癌细胞ECA109为模型,通过慢病毒介导的转基因在细胞中过表达ΔNp63。通过定量PCR及蛋白质印迹法检测3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)表达水平,通过染色质免疫沉淀(ChIP)和萤光素酶报告实验检测ΔNp63蛋白与HMGCR基因5'-非翻译区的结合;在细胞中过表达ΔNp63同时利用RNA干扰抑制HMGCR表达后,通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞迁移情况。结果ECA109细胞中过表达ΔNp63后,HMGCR的mRNA和蛋白质表达水平均提高(P均<0.01)。ChIP及萤光素酶报告实验结果提示,ΔNp63识别位点位于HMGCR启动子-728~-747 bp区域。过表达ΔNp63同时抑制HMGCR表达组24、48、72 h时细胞增殖能力均低于单纯过表达ΔNp63组(P均<0.05),细胞凋亡水平高于单纯过表达ΔNp63组[(26.9±1.9)%vs(16.6±1.5)%,P<0.01],细胞的迁移率低于单纯过表达ΔNp63组[(33.4±3.1)%vs(52.2±2.6)%,P<0.01]。结论ΔNp63通过上调HMGCR转录表达促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖及迁移。

阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析

目的克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)(EC:1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达。方法用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异。结果获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列,命名为AvHMGR(GenBank登记号:FJ455511)。AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性,含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,N-端有两个跨膜结构域。保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族。AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。结论从阳春砂中克隆了AvHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础。

植物萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的生物信息学分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的橡胶、烟草、辣椒、穿心莲等植物的萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明该类酶基因的全长包括5′、3′非翻译区和一个开放阅读框,无信号肽,是一个跨膜的亲水性蛋白,包括两个功能HMG-CoA结合motif及两个功能NADPH结合motif,α-螺旋和不规则盘绕是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间布局上折叠成“V”形,“V”形的两臂由螺旋状的N结构域和S结构域构成,中间部分由L结构域构成。

细纹豆芫菁3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)是甲羟戊酸途径的关键酶。获得芫菁体内HMGR基因信息是确定甲羟戊酸途径与斑蝥素合成相关性的基础。本研究利用RACE技术从细纹豆芫菁Epicauta mannerheimi(Mklin)体内克隆获得HMGR基因全长cDNA序列,命名为EmHMGR(GenBank登录号为JQ690539)。该基因全长3118bp,其中5'端非翻译区178bp,3'端非翻译区414bp,开放阅读框2526bp,编码842个氨基酸。推测的蛋白质分子量为92.8kDa,理论等电点为6.0,预测分子式为C4135H6604N1098O1216S50,不稳定系数为43.37,总亲水性系数为0.091,为疏水性不稳定蛋白。序列分析发现该基因编码的蛋白与已报道的其他昆虫HMGR的氨基酸序列一致性达50%以上,而且包含HMGR_Class I保守功能域、固醇敏感多肽区及HMGR蛋白的其他保守功能位点。系统进化分析发现该基因与叶甲科昆虫HMGR基因的关系最近。本研究首次从芫菁科昆虫体内克隆获得甲羟戊酸途径的关键酶EmHMGR基因,为后期芫菁体内斑蝥素生物合成途径的研究奠定了基础。

3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态与血浆高浓度低密度脂蛋白的风险

目的:研究潮汕人群3-羟-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶基因多态性与血浆高浓度低密度脂蛋白(LDL)的风险。方法:收集潮汕籍汉族高浓度LDL 792例,并与1 073名健康人对照,用SNPstream技术检测样本HMG-CoA还原酶基因多态性。结果:2个单核苷酸多态性位点(rs3846662和rs12916)与高浓度LDL均有相关性(P<0.05),2个单倍型G-T-C和A-C-C在两组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HMG-CoA还原酶2个单核苷酸多态性和2个单倍型均与血浆高浓度低密度脂蛋白LDL存在相关性。

HMG-CoA还原酶ScrFI基因多态性对高胆固醇血症和AI的影响:一个中老年人群的横断面研究

目的:探讨3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的基因多态性对高胆固醇血症和动脉粥样硬化指数(AI)的影响。方法:检测南京市常住汉族174名中老年人血总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),计算AI;使用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测HMG-CoA还原酶ScrFI基因多态性。结果:高胆固醇血症患者87例(高胆固醇组),男21例,女性66,平均年龄(63.59±8.37)岁;胆固醇正常87例(正常组),男21例,女66例,平均年龄(62.92±7.60)岁。高胆固醇组AA基因型频率为25.10%,Aa基因型频率为55.31%,aa基因型频率为19.59%;正常组AA基因型频率为18.39%,Aa基因型频率为52.87%,aa基因型频率为28.74%;高胆固醇组的a等位基因频率为55.17%,高于正常组的47.13%,但差异无统计学意义(P>0.05),AA基因型人群的血HDL-C水平显著高于Aa和aa基因型人群(P<0.05);胆固醇正常组AA基因型人群的AI显著低于aa型基因人群(P<0.05);两组人群的AI随突变型杂合子和突变型纯合子的发生逐渐升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HMG-CoA还原酶ScrFI基因多态性可能是高胆固醇血症发生的遗传易感因素之一;HMG-CoA还原酶ScrFI基因突变可能会影响HMG-COA还原酶的活性,降低对胆固醇的抑制作用,增加总胆固醇和LDL-C的合成,较暴露于同样环境中的基因非突变型人群发生高胆固醇血症和动脉粥样硬化的风险可能会增高。

摩那克灵K，一种新低胆固醇剂，特别能抑制3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A还原酶

摩那克灵Ｋ，一种新低胆固醇剂，特别能抑制３－羟基－３－甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶真菌代谢产物摩那克灵Ｋ（ＭｏｎａｃｏｌｉｎＫ）作为一种新低胆固醇剂已在本实验室（１）从红色红曲（Ｍｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒ）培养物中被分离出。本化合物的化学结构（结构研究的细...

三七3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的克隆和生物信息学分析

目的克隆三七总皂苷甲羟戊酸合成途径中的1个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)基因,为进一步研究HMGR蛋白的功能及开展三七皂苷的合成生物学研究奠定基础。方法根据NCBI上已公布的同属人参的HMGR基因全长序列(登录号GU565097.1)设计特异性引物。利用RT-PCR技术,以三七愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板扩增基因片段;并对其编码的蛋白进行生物信息学预测和基因表达分析。结果序列分析表明,获得的三七HMGR(命名为PnHMGR)基因的cDNA序列大小为1 893 bp,该序列与人参、刺五加和杜仲中HMGR基因的一致性分别达到98%、93%、80%,且含有大小为1 725 bp的开放阅读框,经Genbank查询为一新的cDNA。生物信息学预测PnHMGR基因编码蛋白包含2个跨膜区,不含信号肽,具有HMGR催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR检测到PnHMGR基因在三七细胞生长30 d表达量最高。结论首次从药用植物三七中克隆得到HMGR基因的编码区序列,为进一步鉴定PnHMGR的功能和开展三七皂苷的合成生物学研究奠定了基础。

植物3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)研究进展

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)是甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA)的第一个限速酶,在植物细胞质萜类化合物合成过程中起着关键作用,不仅对植物的生长发育至关重要,而且对植物适应苛刻的环境条件也很重要。本文就植物HMGR的结构特征、生物学功能及其调控机制的相关研究进展进行综述,旨在为园艺植物的遗传改良及新品种的培育提供分子基础和理论依据。

急性白血病患者LDL受体及HMG-CoA还原酶活性变化的临床意义

目的探讨急性白血病(AL)患者低密度脂蛋白胆固醇受体(LDLR)活性及3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶活性变化的临床意义。方法用四氮甲唑蓝比色法检测AL患者的细胞生长抑制率、LDLR活性、HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀对白血病细胞增殖作用的影响;紫外分光光度法测定白血病细胞HMG-CoA还原酶活性。结果与对照组比较,AL初治组、复发组及耐药组的白血病细胞、LDLR活性、HMG-CoA还原酶活性均升高(P均<0.01)。阿托伐他汀以时间和剂量依赖性方式抑制AL初治、复发和耐药患者骨髓细胞的增殖。结论检测LDLR及HMG-CoA还原酶活性对AL患者的病情判断、复发及预后估计可能有一定意义。阿托伐他汀具有抑制白血病细胞增殖作用,HMG-CoA还原酶抑制剂可能有辅助治疗AL的作用。

阿尔茨海默病患者HMG-CoA还原酶基因多态性与血脂关系的研究

目的探讨3-羟-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶基因多态性与阿尔茨海默病(AD)的关系。方法用PCR-RFLP方法分析HMG-CoA还原酶第2内含子区ScrF1酶切多态性。结果ScrF1酶切多态性基因型频率、等位基因A、a频率在组间比较差异无显著性(P>0.05),但基因型为AA的AD患者,其总胆固醇(TC)水平显著高于基因型为aa的AD患者(P<0.01)。结论HMG-CoA还原酶ScrF1酶切多态性与AD无相关性,但患者组AA基因型与TC水平密切相关。

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性与甘草酸含量的相关性分析

目的:揭示甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的多态性,并阐述HMGR基因多态性与甘草酸含量的相关性。方法:以甘草酸含量差异显著的甘草个体为材料,通过RT-PCR法扩增其HMGR基因编码区;与载体pMD19-T连接后克隆测序;通过多重比对进行HMGR基因多态性分析,及与甘草酸含量之间的关联分析。结果:HMGR基因编码区多态性包括整码突变、碱基置换突变、拷贝数多态性及等位基因杂合;HMGR编码氨基酸序列中存在以下4种类型变异,即-HSL,-HSV,GALLV,GALSV,其中-HSV型为甘草中普遍存在类型,-HSL型为甘草酸低含量甘草的特有类型,GALSV型为甘草酸高含量甘草特有类型。结论:甘草HMGR基因编码区具有丰富的多态性,和甘草酸含量之间具有相关性。

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性对其编码酶催化效率的影响

目的:利用GC-MS方法分析甘草不同3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因型表达蛋白的催化效率,为揭示甘草HMGR多态性在优质甘草药材形成中的作用奠定基础。方法:以从甘草中克隆的4种HMGR基因突变型构建表达载体,转化Escherichia coli BL21,进行诱导表达、检测、纯化及体外酶促反应,采用TLC及GC-MS对反应产物进行定性及定量分析。结果:L/V型突变(-HSL,-HSV)催化活性近似,GA插入型突变(GALLV,GALSV)催化活性近似,但插入型突变的催化活性显著高于前者,是前者的2倍左右。结论:甘草功能基因HMGR基因多态性可能是甘草优质药材形成的分子基础。

滇重楼3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶PpHMGR基因的克隆及分析

为了克隆滇重楼编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的基因,并分析其在滇重楼不同组织中差异表达。本研究采用RT-PCR的方法从滇重楼根茎中克隆到编码HMGR的基因全长序列,用生物信息学的方法对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白结构及功能的预测分析,并对该蛋白进行相似性检索、构建进化树;利用实时荧光定量的方法检测该基因在滇重楼不同组织中的差异表达。结果获得了全长1 494 bp的ORF,编码497个氨基酸,命名为PpHMGR(GenBank登记号:MG601751)。PpHMGR编码的蛋白含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族。PpHMGR在根茎的表达量明显高于叶片、茎和芽,其中在3年生根茎的表达量又明显高于1年和5年生根茎。本研究从滇重楼中克隆了PpHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探讨滇重楼皂苷的合成生物学研究提供了科学依据。

白细胞介素-1β激活HMGCoA还原酶促进HepG2细胞脂质积聚

目的:探讨白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)对HepG2细胞羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A,HMGCo A)还原酶及脂质积聚的影响。方法:200μg/m L低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)负荷下的HepG2细胞分别给予0 ng/m L(对照组)、20 ng/m L(炎症组)IL-1β处理24 h。荧光定量PCR(RT-PCR)、Western blot分别测定HMGCo A还原酶mRNA及蛋白表达水平;薄层层析法检测HMGCo A还原酶活性;同位素标记法评估胆固醇合成情况;油红O染色及酶法定量检测细胞内脂质。结果:IL-1β处理下,HepG2细胞HMGCo A还原酶mRNA表达水平为对照组的(1.54±0.04)倍(t=5.619,P=0.001)、蛋白表达水平为对照组的(1.92±0.12)倍(t=7.745,P=0.002),且HMGCo A还原酶的酶活性为对照组的(1.73±0.25)倍(t=2.476,P=0.048)。IL-1β处理使HepG2细胞的胆固醇合成增多为对照组的(1.32±0.11)倍(t=2.316,P=0.036)。IL-1β处理的HepG2细胞内红染的脂滴显著多于对照组,且IL-1β处理组细胞内总胆固醇含量(22.43±1.62)为对照组(14.90±1.11)的1.51倍(t=3.845,P=0.018),胆固醇酯的含量(3.84±0.20)为对照组(1.41±0.05)的2.72倍(t=11.730,P=0.000)。结论:IL-1β可以上调HepG2细胞HMGCo A还原酶的mRNA和蛋白表达水平,并增强其酶活性,促进HepG2细胞内胆固醇合成和脂质积聚。

山楂中抑制HMG-CoA还原酶的活性成分及其协同效应的研究

目的:研究山楂降血脂活性成分及作用机制。方法:以HMG-CoA还原酶活性为靶标,采用大孔树脂和硅胶等进行分离纯化,筛选HMG-CoA还原酶抑制剂。结果:获得4个对HMG-CoA还原酶活性具有较强抑制作用的化合物,为槲皮素、金丝桃苷、芦丁和绿原酸,4个化合物抑制率之和为50.01%,复配后的抑制活性为79.48%。结论:槲皮素和金丝桃苷为山楂中抑制HMG-CoA还原酶活性的主要活性成分,且单体之间存在协同作用。

茵陈五苓散含药血清对LO2细胞株LDL-R及HMG-CoA还原酶表达的影响

目的探讨茵陈五苓散含药血清调节血脂的可能机制并筛选其最佳给药浓度及作用时间。方法将40只雄性SD大鼠随机分为菌陈五苓散低、中、高剂量组,辛伐他汀组及空白组,每组8只。菌陈五苓散低、中、高剂量组分别给予4、8、16 g/(kg·d)菌陈五苓散;辛伐他汀组给予1 mg/(kg·d)辛伐他汀片;空白组给予20 mg/(kg·d)生理盐水,各组大鼠每天灌胃2次,连续3天,制备含药血清。取对数生长期的LO2细胞株经过24 h孵化贴壁后随机分为茵陈五苓散低、中、高剂量组,辛伐他汀组及空白组,每组各18孔,每孔分别加入受试血清10μl。同浓度的18孔再分为3组,每组6孔,分别培养24、48、72 h,实时荧光定量法检测各组细胞的低密度脂蛋白受体(LDL-R)mRNA及3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶mRNA表达情况。结果与空白组比较,茵陈五苓散各剂量组及辛伐他汀组各时间点LDL-R mRNA表达均明显升高,HMG-Co A还原酶mRNA表达均明显下降(P<0.05或P<0.01),其中茵陈五苓散在中浓度、干预48 h的条件下LDL-R mRNA表达达高峰、HMG-Co A还原酶mRNA表达最低。结论茵陈五苓散含药血清调节血脂的机制可能与其能明显上调LDL-R表达、下调HMG-Co A还原酶表达有关,在药物浓度为中浓度、干预时间为48 h时效果最佳。

蓝桉叶片桉叶素生物合成机理研究

为探明蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)叶片桉叶素合成过程中关键酶活性与桉叶素含量的关系,以不同发育阶段的蓝桉叶片为研究对象,测定桉叶素相对含量和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI)、香叶基焦磷酸合酶(GPPS)、桉叶素合酶(CinS)活性,并对其进行方差分析、相关性分析、通径分析.结果表明,随着蓝桉叶片成熟度增加,桉叶素相对含量逐渐增加,HMGR、DXS、GPPS、IPPI的酶活性逐渐下降.在一个完整的年生长周期内,桉叶素相对含量在7月份显著高于其余月份,HMGR、DXS、GPPS、CinS活性在5、6月份显著高于其余月份.桉叶素相对含量与DXS、CinS活性显著正相关,与HMGR、IPPI、GPPS酶活性极显著负相关.研究结果表明,在5、6月份增强蓝桉幼嫩叶片的DXS和CinS活性,可以有效提高桉叶素积累,进而提高蓝桉桉叶油的产量和品质.

罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸（MVA）途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。