3-脱氢莽草酸生物合成的代谢工程

3-脱氢莽草酸,是芳香族氨基酸生物合成代谢途径中一种重要的中间产物,可作为一些化学合成制剂和药物中间原料。这样以无毒可再生物质为起始原料的合成方法与传统的有机合成化学制剂的方法相比,对环境更加有利。此外,它还是一种十分有效的抗氧化剂。工业上一般采用化学合成法和发酵法来生产3-脱氢莽草酸,随着代谢工程的兴起,使得更加理性改造菌株成为可能,这更加促进了发酵法的广泛应用。主要介绍了代谢工程在生物合成3-脱氢莽草酸生产菌改造中的应用情况,其中涉及3-脱氢莽草酸生物合成途径中相关基因及其酶的调控、中心代谢途径的改造和3-脱氢莽草酸合成支路的修饰等,并探讨了将来的发展前景。

3-脱氢莽草酸甲酯与肼类化合物反应的选择性

以可再生生物质资源莽草酸为原料,在经酯化和2-碘酰基苯甲酸(IBX)氧化制得3-脱氢莽草酸甲酯的基础上,研究了在不同反应溶剂中和不同反应温度下,3-脱氢莽草酸甲酯分别与水合肼、乙酰肼、苯肼和乙酰胺选择性地得到非芳构化、部分芳构化和芳构化产物的反应.该方法具有选择性高、操作简单和条件温和等优点,为可再生非粮生物质资源莽草酸的利用提供了一种新的思路.

丙二腈及氰乙酸酯参与的3-脱氢莽草酸甲酯缩合-芳构化-环合串联反应

3-脱氢莽草酸甲酯与丙二腈、氰乙酸乙酯及氰乙酸甲酯等活性亚甲基化合物在一定条件下发生缩合、芳构化及环合反应,可方便地构建C—C键并得到多取代的2-氨基苯并呋喃类化合物(3a^3e,4a和4b),其中化合物3a中的氰基和甲氧羰基可分别进行选择性水解.该方法具有原料易得、条件温和、操作简单及收率高等优点,为可再生生物质资源莽草酸的多样化转化和利用提供了新思路.

3-脱氢莽草酸甲酯、乙酯的合成与表征

以莽草酸为起始原料,在酰化试剂二氯亚砜作用下,分别与甲醇和乙醇发生酯化反应得到莽草酸甲酯及乙酯,然后以四氢呋喃为溶剂,在氧化剂2-碘酰基苯甲酸(IBX)作用下,制备得到3-脱氢莽草酸甲酯和3-脱氢莽草酸乙酯。本方法采用可再生原料莽草酸为起始物,以性能温和、选择性好、绿色环保的IBX为氧化剂,具有操作简便、收率高等优点。中间体和目标化合物结构经1H NMR、EI-MS、IR等方法确证。

利用代谢工程改善大肠杆菌的3-脱氢莽草酸生产

3-脱氢莽草酸是芳香族氨基酸合成代谢途径中的一种重要中间产物。除可作为一种高效的抗氧化剂,还可用于合成己二酸、香草醛等一些重要的化工产品,具有重要的应用价值。相关研究证明具有去酪氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroFFBR以及转酮醇酶基因tktA可以有效影响3-脱氢莽草酸的过量合成。通过增加aroFFBR和tktA串联过量表达的拷贝数,可使工程菌株在摇瓶发酵条件下3-脱氢莽草酸产量提高2.93倍。通过同源重组无痕基因敲除技术依次敲除出发菌大肠杆菌Escherichia coli AB2834的乳酸、乙酸、乙醇等副产物合成途径中的重要基因ldhA、ackA-pta和adhE,可使工程菌株的3-脱氢莽草酸产量进一步提高,达到了1.83 g/L,是初始出发菌株大肠杆菌E.coli AB2834产量的6.7倍。利用5 L发酵罐进行分批补料发酵,62 h后工程菌株3-脱氢莽草酸产量达到了25.48 g/L。本研究可为构建有应用前景的3-脱氢莽草酸生产菌株提供重要参考。

莽草酸芳构化制备二芳基胺类化合物

以莽草酸为起始物,经酯化及IBX氧化制备得到3-脱氢莽草酸甲酯。在甲醇溶剂中及对甲苯磺酸的催化下,3-脱氢莽草酸甲酯与芳香伯胺类化合物发生缩合-脱水芳构化反应,制备得到一类二芳基胺类化合物,即3-芳胺基-4-羟基苯甲酸甲酯类化合物。该方法以廉价的可再生资源为起始物,具有操作简单、条件温和、收率高等优点,是制备二芳基胺类化合物的一种有效途径。

石榴果实没食子酸及其合成相关物质HPLC测定体系优化

建立了‘泰山三白甜’石榴果实不同部位没食子酸及其合成相关物质的高效液相色谱（HPLC）定性和定量检测方法。色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18（4.6 mm×150 mm,5μm）,没食子酸以乙腈-2%冰乙酸水溶液为流动相（20∶80）,检测波长270 nm;莽草酸和3-脱氢莽草酸以甲醇-1%磷酸水溶液（5∶95）为流动相,检测波长214 nm;五没食子酰葡萄糖以乙腈-0.5%磷酸水溶液（20∶80）为流动相,检测波长275 nm,4种物质均等度洗脱,流速均为0.8 m L/min,柱温均为30℃。结果表明,4种物质在一定线性范围内的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,检测限为0.12-0.24 mg/L;加标回收率为98.9%-102.5%,相对标准偏差（RSD）为1.2%-2.2%。‘泰山三白甜’石榴果实不同部位没食子酸、莽草酸、3-脱氢莽草酸和五没食子酰葡萄糖含量存在显著差异,果皮中含量最高,果汁次之,种子中最低。该方法操作简单,灵敏度高,重复性好,可用于没食子酸及其合成相关物质的快速鉴定及含量测定。

茶树中莽草酸途径DHD/SDH基因的表达调控

3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶（DHD/SDH）是茶树莽草酸途径中唯一的双功能酶，一方面催化生成莽草酸，另一方面可以催化生成没食子酸. 为研究DHD/SDH基因在茶树代谢途径中表达及调控模式，通过在线预测、RLM-RACE和qPCR技术探讨miRNA对DHD/SDH的调控及表达模式. 在获得的茶树miRNA序列的基础上，对本试验室克隆得到的茶树3个DHD/SDH进行miRNA预测和鉴定. 获得了4个miRNA参与裂解CsDHD/SDH基因. 其中miR5180b、miR1510b-5p和miR^24共同靶向CsDHD/SDH2，miR868-5p作用于CsDHD/SDH3. 同时对茶树中3个CsDHD/SDH表达模式进行检测. 不同激素处理下，CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3表达模式一致. CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3的表达模式存在协同作用. 本研究表明CsDHD/SDH1与CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3之间的表达存在负反馈调节，CsDHD/SDH1上调表达时会导致互补基因CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3下调表达. （图4 表2 参25）