谷氨酸棒杆菌3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶基因的克隆与过量表达

本实验对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)AS10111及其亚硝基胍诱变获得的丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型、抗3-甲基色氨酸突变菌株JLC1中3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶(DS)基因进行克隆和序列分析,将突变体来源DS基因构建pZ8-1-DSM重组质粒,在谷氨酸棒杆菌突变株JLC1中进行表达,重组菌株JLC1(pZ8-1-DSM)DS酶活力分别是宿主菌和野生型菌株DS酶活力的5.9和7.3倍,色氨酸产量达到14.90g/L,较宿主菌提高了65%。这表明通过在谷氨酸棒杆菌中过量表达3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶基因可以有效提高该酶活力和色氨酸的产量。

利用代谢工程改善大肠杆菌的3-脱氢莽草酸生产

3-脱氢莽草酸是芳香族氨基酸合成代谢途径中的一种重要中间产物。除可作为一种高效的抗氧化剂,还可用于合成己二酸、香草醛等一些重要的化工产品,具有重要的应用价值。相关研究证明具有去酪氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroFFBR以及转酮醇酶基因tktA可以有效影响3-脱氢莽草酸的过量合成。通过增加aroFFBR和tktA串联过量表达的拷贝数,可使工程菌株在摇瓶发酵条件下3-脱氢莽草酸产量提高2.93倍。通过同源重组无痕基因敲除技术依次敲除出发菌大肠杆菌Escherichia coli AB2834的乳酸、乙酸、乙醇等副产物合成途径中的重要基因ldhA、ackA-pta和adhE,可使工程菌株的3-脱氢莽草酸产量进一步提高,达到了1.83 g/L,是初始出发菌株大肠杆菌E.coli AB2834产量的6.7倍。利用5 L发酵罐进行分批补料发酵,62 h后工程菌株3-脱氢莽草酸产量达到了25.48 g/L。本研究可为构建有应用前景的3-脱氢莽草酸生产菌株提供重要参考。

过表达pps基因和aroG^(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。

L-色氨酸的系统代谢网络调控研究进展

随着L-色氨酸市场需求增大,L-色氨酸生物合成调控逐渐成为研究热点。该文综述了L-色氨酸的应用范围、生产方式及生物合成代谢调控策略。从L-色氨酸的系统代谢网络出发,综述了L-色氨酸在中心代谢途径、莽草酸途径以及分支酸途径中的遗传调控策略,主要包含了增加胞内前体物、阻断分支酸途径、削弱负调控和改造转运系统等。