双齿围沙蚕β-1,3-葡萄糖苷酶分离纯化及其酶学性质

从双齿围沙蚕中提取、分离纯化β-1,3-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。通过80%饱和度(NH4)2SO4沉淀从双齿围沙蚕中得到粗β-1,3-葡萄糖苷酶,粗酶依次经DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析进行分离纯化。酶纯化倍数为35.74,回收率为39.49%。SDS-PAGE检测表明其分子量为28.7 k Da。该酶最适温度为50℃,最适p H为7,Km为8.2×10-4mol/L,Vmax为3.2×10-4μmol/h。金属离子K+、Mg^(2+)、Fe^(2+)、Ba^(2+)、Ca^(2+)对β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力影响较小,Al^(3+)、Cu^(2+)、Zn^(2+)、Ag^+对β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力抑制较大,其中Zn^(2+)抑制作用最强。双齿围沙蚕可作为β-1,3-葡萄糖苷酶的潜在来源。

嗜热古菌Thermofilum adornatum来源的高温热激活β-葡萄糖苷酶TaBgl3的原核表达及酶学性质研究

【目的】β-葡萄糖苷酶,又称β-D-葡萄糖苷水解酶,属于纤维素酶类,是一种降解纤维素的关键限速酶。来源于嗜热古菌的β-葡萄糖苷酶已被广泛验证具有酸性高温等特性,已成为高温酶的研究热点之一。本文对尚未报道的来源于嗜热古菌中一种热丝菌(Thermofilum adornatum)的GH3家族的葡萄糖苷酶,进行了原核表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。【方法】从NCBI数据库中获得了嗜热古菌(T.adornatum)来源的GH3氨基酸序列,构建重组质粒p ET-30a(+)-TaBgl3,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达重组蛋白;采用磁珠纯化,研究其酶学性质。【结果】重组蛋白TaBgl3的分子量为77.0 kDa;酶学性质结果表明,其最适反应条件为80℃和pH 5.0,在70℃保温处理1–4 h,对TaBgl3的酶活力有促进作用,在最适温度80℃处理2 h后,其激活作用更加明显,能提高40%以上的酶活;其在pH 5.0–8.0下37℃保温1 h,仍具有60%以上的活性;底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)时酶的比活力为144.23 U/mg,米氏常数K值和最大反应速率V分别为1.81 mmol/L和268.10μmol/(mg·min),催化效率为115.47/s;终浓度为5 mmol/L的Cu、Li和EDTA对TaBgl3的酶活有较大的促进作用,可提升39%以上的酶活,而5 mmol/L Fe和5%β-巯基乙醇对酶活有抑制作用,SDS、乙醇和葡萄糖对酶具有很强的抑制作用。【结论】本研究中,TaBgl3是酸性高温酶,且具有较好的热稳定性和热激活特性,这些特征在以后的理论研究及在工业生产中具有一定的科学价值。