α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C>T和539G>C变异导致A_2亚型

为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景,发现并鉴定新的ABO等位基因,采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本,PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序,并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型;进一步研究发现,1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因,另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比,差异在外显子7的467C>T和539G>C变异,导致多肽链P156L和R180P的替换。结论首次发现467C>T和539G>C组合的A2等位基因,中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。

a-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因EXON 7突变形成A311血型基因亚型

本研究对1例产生抗A抗体的血清学正反定型不符的A血型标本进行血型血清学分析及基因分析,以了解其分子基础。采用试管法进行血型血清学的检测,采用PCR-SSP对A基因进行扩增分析,采用Sanger测序法对A血型糖基转移酶基因进行测序分析。结果表明:血清学正反定型不符,初定为A亚型;PCR-SSP扩增检测结果有O、A血型基因的存在;对ABO基因第6外显子测序发现存在c.261delG,显示有O基因;对A、O基因第7外显子进行特异性扩增测序分析显示,在A单倍型基因第7外显子出现c.467 C>T、c.626 G>A的突变,在O单倍型基因第7外显子出现c.646T>A、681G>A、771C>T、829G>A等突变。结论:该献血者在A基因第7外显子的c.626G>A是新的等位基因突变,c.467 C>T是SNP;新突变的GenBank序列号是KC690281,被BGMUT命名为1个新的A等位基因亚型A311。

乙酰半乳糖氨基转移酶3和维生素D受体基因多态性与绝经后妇女骨质疏松的相关性研究

目的研究乙酰半乳糖氨基转移酶3(GALNT3)和维生素D受体(VDR)基因多态性与绝经后妇女骨质疏松的关联性。方法纳入50例绝经后骨质疏松患者作为观察组,50例绝经后无骨质疏松志愿者作为对照组,检测两组女性的腰椎L2~L4、近端股骨颈和全髋骨密度(BMD),采用Taq Man基因分型技术检测GALNT3和VDR标签单核苷酸多态性(tag SNP),比较骨转换标志物(BTM)、血钙和磷水平,采用多因素Logistic回归分析筛选骨质疏松的危险因素。结果观察组GALNT33个位点和VDR 1个位点tag SNP百分比均明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。观察组血清25-羟维生素D3[25-(OH)-D_3]、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(β-CTX)和血钙水平明显低于对照组,血磷水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。回归分析得出:4个tag SNP均是骨质疏松发生的独立危险指标。结论 GALNT3和VDR基因多态性与绝经后妇女骨质疏松密切相关。

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶p.M142I突变导致Ax亚型的分子机制研究

目的 :以一个血型A_x亚型家系为研究对象,探讨我国人群血型中产生A_x亚型的潜在分子机制。方法:采用血清学方法鉴定该家系成员的ABO血型,测定血浆α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶活性,行DNA直接测序和克隆后测序分析ABO基因序列,并构建3D分子模型,就发现的突变对α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶稳定性改变(ΔΔG)的影响进行预测。结果 :血清学鉴定和DNA测序分析显示,先证者的血型为A_xB亚型,其2个女儿分别为A型和AB型,其ABO基因型分别为AW.38/B.01、A1.02B.01、A1.02/AW.38。先证者和其A型女儿的第7外显子均存在c.426G>C杂合突变,导致α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶的氨基酸发生p.M142I改变。分子模建分析提示,该基因突变改变了蛋白局部氨基酸间氢键的数目,从而导致氨基酸间作用力发生改变,而动力学改变,ΔΔG值升高表明其蛋白稳定性降低。结论:α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶p.M142I突变可能通过降低了酶的稳定性导致A_x表现型,而其深入机制有待体外实验进一步研究。

α-1，3-N-乙酰半乳糖胺等位基因421T〉C突变导致A抗原弱表达

目的探讨1例ABO血型系统A变异型的分子遗传学背景。方法采用血清学方法鉴定ABO血型，测定血浆α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶的活性，用PCR扩增AB0基因的7个外显子及启动子序列，测序分析第7外显子单倍体。结果先证者红细胞ABO血型为A弱表现型，AB0基因全编码区测序发现8处核苷酸杂合位点，分别为第6外显子的261delG缺失和297A／G、第7外显子的421c／T、467C／T、646T／A、681G／A、771C／T以及829G／A杂合变异。单链测序分析提示，其中1条为002等位基因，另一个等位基因除421T〉C和467C〉T突变外，其他变异位点与A101等位基因一致。421T〉C突变可导致A糖基转移酶第141位丝氨酸替换为脯氨酸（Serl41Pro）。结论产生弱A表型的原因可能是由于A糖基转移酶基因421T〉C突变引起编码的氨基酸改变，使α-1，3-N乙酰半乳糖胺转移酶活性减弱，导致A抗原弱表达。

α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和745C〉T突变的研究

目的通过对1个罕见的A3亚型家系进行分子遗传学分析，探讨α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因突变对于A抗原表达的影响。方法采用血型血清学方法对先证者及家系成员进行ABO血型鉴定，应用PCR产物直接测序和基因克隆法对ABO基因的第6、7外显子进行序列分析以及单倍型分析。结果先证者红细胞包含弱A抗原，同时血清中含有抗-A和抗-B抗体。直接测序结果显示ABO基因第6外显子存在261delG突变，第7外显子存在467C〉T和745C〉T两个杂合位点。基因克隆序列分析得到两个等位基因A307和001。A307基因序列与A101基因比对在第467位碱基为C〉T突变和第745位碱基为C〉T，导致多肽链P156L和R249W替换。结论α-1，3半乳糖基转移酶基因467C〉T和745C〉T突变产生A307基因型，导致A抗原表达减弱。

一例α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因389T〉C突变的分析

目的对1例罕见Ax亚型的个体进行分子遗传学分析，探讨α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因突变对A抗原表达的影响。方法采用聚合酶链反应扩增血型血清学鉴定为Ax血型的样本ABO基因第6、7外显子序列，对PCR产物直接进行测序，发现杂合序列后进一步采用单倍体特异性引物进行序列测定。结果先证者红细胞含有弱A抗原，同时血清中含有抗-A和抗-B。直接测序分析发现ABO基因序列的261delG和389C／T杂合。单倍型序列分析得到两个等位基因Ax22和O01。Ax22基因序列与A101基因比对在第389位碱基为T〉C突变，导致多肽链发生L130P氨基酸替换。结论α-1，3半乳糖基转移酶基因389T〉C突变导致A抗原表达减弱。

a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和804insG变异导致Ael亚型

目的研究ABO基因的a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因变异对于A抗原表达的影响。方法通过标准血型血清学方法鉴定3份A亚型样本，应用聚合酶链反应一序列特异性引物扩增ABO基因第6、7外显子PCR产物直接测序及基因克隆测序等方法进行ABO基因分型及单倍型序列分析。结果3份A亚型样本的血清学检测结果均为Ael型，其中2份样本分别含有Ae108和001等位基因，1份样本含有Ae108和004等位基因。Ael08等位基因与A101等位基因相比，差异在第7外显子的467C〉T和804insG变异，导致多肽链P156L替换和269位氨基酸移框突变。结论a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和804insG变异可能是Ael亚型分子基础之一。

A糖基转移酶基因变异所致A_(3)表型1例的遗传学分析

目的探讨1例A3表型个体的血清学特性和分子机制。方法选取2022年5月12日就诊于中国医科大学附属第四医院的1名27岁汉族女性作为研究对象。使用标准血清学方法检测其ABO血型,通过PCR扩增产物直接测序法鉴定ABO基因及第6~7外显子的单链序列,并使用生物信息学软件对变异位点进行分析。结果检测结果提示该个体为A3表型,其第6、7外显子存在c.261delG、c.467C>T和c.745C>T杂合变异。单链测序结果提示样本存在ABO*A3.07和ABO*O.01.01等位基因,其中ABO*A3.07等位基因在ABO*A1.02等位基因的背景下存在c.745C>T(p.R249W)变异。生物信息学分析预测c.745C>T(p.R249W)为可能有害变异,自由能变化(ΔΔG)值预测其可能影响蛋白稳定性。蛋白模拟模型提示p.R249W可造成α-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶局部氢键网格的改变。结论α-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因的c.745C>T(p.R249W)变异可能造成酶蛋白结构和功能的失稳,进而导致A抗原表达减弱。

siRNA下调Smad3基因后对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶表达的影响

目的以Smad3基因为研究对象,筛选出该基因的有效siRNA干扰载体,并探讨下调表达Smad3基因对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcTs)家族mRNA水平表达的影响。方法将事先构建的3个带有荧光标记的干扰载体分别转染人肝星状细胞株(HSC)中,通过RT-PCR、Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平检测干扰效率。并通过转染有效的Smad3基因的siRNA表达载体,检测下调Smad3以后对糖基转移酶ppGalNAcTs家族mRNA表达的影响情况。结果成功筛选到Smad3基因的有效siRNA干扰载体,检测出转染了Smad3的siRNA表达载体的肝星状细胞中Smad3的mRNA和蛋白表达都受到了抑制,而糖基转移酶ppGalNAcTs的mRNA表达也随之发生了一些变化。结论成功筛选到一个Smad3基因的siRNA干扰载体,继而可转染人肝星状细胞,并抑制其中Smad3蛋白的表达,为研究siRNA方法在肝纤维化中的治疗作用提供了实验基础和理论支持。

六基因编辑猪-食蟹猴异种肾移植围手术期监测初步报道

目的探讨六基因编辑猪-非人灵长类动物异种肾移植模型的构建。方法将人源化基因编辑猪(GTKO/β4GalNT2KO/CMAHKO/hCD55/hCD46/hTBM)的肾脏移植给食蟹猴,观察受体存活情况及恢复血流灌注后肾脏情况。定期监测肾脏实质回声、血流变化及大小;进行血常规、肾功能检测及电解质检测;监测尿液、粪便及体质量动态变化。食蟹猴生命终点取移植肾、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、盲肠行病理学检查。结果受体术后7 d死亡。恢复血流后,肾脏灌注良好,器官质地柔软,色泽正常。受体生命终点时见肾脏腹侧有少量脓性分泌物附着,明显充血肿大,呈“大红肾”外观。术后随时间延长,肾实质回声增高,血流减少,皮质逐渐增厚,肾周及腹腔有少量积液。受体术后外周血红细胞、血红蛋白、白蛋白及血小板进行性下降,血清肌酐在术后7 d升高至308μmol/L,K^(+)变化不大。术后即有淡黄色尿液排出,术后3 h内即恢复饮食及饮水并排淡黄色成形大便1次。术后1 d内尿液颜色逐渐变淡红至恢复正常,尿常规检测结果相符。术后2 d晨起排褐色血便2次,量较多,予以奥美拉唑进行抑酸治疗,至术后4 d大便恢复正常。β2-微球蛋白在术后7 d增至0.75 mg/L。体质量增加1.7 kg。尸检病理学检查发现移植肾间质水肿出血,大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润,小动脉壁及动脉腔内淋巴细胞浸润,有动脉炎改变;盲肠间质有淋巴细胞浸润;脾脏组织有淤血表现;其余器官未见明显异常改变。结论人源化基因编辑猪-非人灵长类动物异种肾移植模型构建获得初步成功,术后受体存活时间达1周。

GCNT3通过PI3K/Akt/mTOR和RhoA/ROCK/Cofilin途径促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭(英文)

β-1,3-半乳糖-O-糖基-糖蛋白β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(β-1,3-galactosyl-O-glycosyl-glycoproteinβ-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase,GCNT3)是黏液蛋白质生物合成中不可缺少的一类N-乙酰葡萄糖转移酶。越来越多的证据表明,GCNT3的异常表达与肿瘤的侵袭以及病人的生存率有关,然而相关的研究仍较少报道。本研究旨在揭示GCNT3在调控肝细胞癌进程中的潜在机制。本研究首先利用高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)和癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas databases,TCGA)数据库分析肝癌和正常组织中GCNT3的mRNA表达水平,结果表明,肝癌组织中GCNT3的mRNA表达水平高于正常组织(P≤0.001)。同时利用免疫组化、Western印迹进一步分析了肝癌组织、癌旁组织、正常组织中GCNT3蛋白的表达,发现有30%肝癌组织GCNT3表达水平高于癌旁组织和正常组织。随后,在肝癌细胞系HCCLM3和Huh7细胞中,采用CCK-8、平板克隆、划痕实验、Transwell实验分析GCNT3对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,结果显示,敲低GCNT3可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而过表达GCNT3发挥相反作用。细胞周期和Western印迹结果显示,GCNT3调控G_(0/)G_1期关键蛋白质的表达来促进肝癌细胞周期G_1/S的转换。进一步探究发现,GCNT3可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进细胞增殖;以及GCNT3上调RhoA/ROCK/Cofilin通路关键蛋白质的表达来促进F-肌动蛋白(F-actin)的形成,从而参与细胞的迁移和侵袭。总之,本研究通过对GCNT3在肝癌细胞中的功能分析,初步证明,GCNT3与肝癌细胞增殖、迁移和侵袭中的功能有关,证实了GCNT3在肝癌临床治疗中的潜在价值,为肝癌治疗和诊断提供了新思路。

ABO基因第7外显子c.940A>G变异致AW37B亚型及其家系的调查分析

目的分析1例Aw37B亚型患者及其家系的血清学和分子特征,探讨其分子生物学机制及在疑难血型鉴定和临床输血中的意义。方法应用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-sequence specific primer,PCR-SSP)进行ABO基因分型,并对ABO基因的全部外显子进行扩增产物直接测序。进一步对第6、7外显子进行克隆测序。结果先证者红细胞为A弱B表型,其血清样本中含有弱反应性抗-A抗体,依据血清学特征可定义为AwB血型。血型基因分型检测到A和B等位基因。基因克隆测序显示在A等位基因第7外显子存在ABO*AW.37的特征性变异c.940A>G,导致多肽链第314位的赖氨酸(Lys)被谷氨酸(Glu)替换。同时测序发现先证者的女儿遗传了ABO*AW.37等位基因。结论ABO血型基因第7外显子c.940A>G变异导致α-1,3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性降低,产生Aw37表型。

一例ABO血型系统Aw43亚型的基因突变研究

目的研究1例AB0血型A亚型的分子机制。方法先证者及其家系成员（父母和姐姐）的AB0血型正反定型采用标准血清学技术。用PCR扩增先证者及其家系成员ABO基因的全部编码序列并进行双向测序分析。结果先证者红细胞与抗A呈现混合视野凝集，与抗B不凝集；其血清与A、0细胞均不凝集，与B细胞呈现凝集，血清学特性可定义为Aw亚型。ABO基因测序分析显示先证者1A／G、106G／T、188A／G、189C／T、220C／T、261G／del、297A／G、467C／T、646A／T、681A／G杂合。家系调查显示其母亲血清学表型特性和测序结果与先证者完全一致，其父亲基因型为B10I／002、姐姐为002／002。结合家系成员结果，可推断先证者AB0基因型中一个等位基因为002，另一个等位基因为新等位基因；它与A102相比存在1A＞G，导致起始密码子改变，已被红细胞血型基因数据库正式命名为Aw43。结论发现1例Aw43亚型，其α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因存在1A＞G和467C＞T变异。

一例ABO血型Aw33亚型新等位基因的分子生物学鉴定

目的研究1例ABO血型A亚型的分子生物学机制。方法患者ABO血型正反定型采用卡式法和试管法分别进行鉴定。利用PCR序列特异性引物检测该患者所含ABO基因。PCR扩增该患者ABO基因1~7外显子的全部编码序列并进行测序分析,通过克隆测序进行ABO基因单倍型分析。结果患者红细胞与抗A呈现弱凝集,与抗B不凝集,其血清与Ac凝集1+,与Bc呈现4+凝集,血清学特性可定义为Aw亚型。ABO基因测序分析显示患者存在c.106G>T、c.188G>A、c.189C>T、c.220C>T、c.297A>G、c.467C>T、c.543G>C、c.646T>A、c.681G>A、c.771C>T、c.829G>A杂合变异和c.261delG缺失。结合克隆测序结果,推测患者ABO基因型为ABO*Aw.33.new/O.01.02;与ABO*A1.01相比存在c.467C>T和c.543G>C变异,与ABO*A1.02相比存在c.543G>C变异,该新等位基因序列已提交GenBank,序列号为MK302122。结论发现1例Aw33亚型新的等位基因,其GTA转移酶基因存在c.467C>T和c.543G>C变异。

A血型亚型与糖基转移酶活性关系的初步研究

目的:通过研究A亚型等位基因及其编码糖基转移酶的活性,进而了解不同A亚型的抗原性。方法:血型表型的定型采用微孔板法初检,试管法确认;糖基转移酶活性的检测采用血清学试管法;A血型亚型等位基因的检测采用DNA分子测序的方法。结果:在与抗A1不凝集的8例A亚型、24例A亚型B的标本中,无α-1、3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性的分别为7例和24例;在与抗A1弱凝集的6例A型、13例AB型标本中,出现酶活性的分别为1例和4例。95.45%(42/44)的A亚型无α-1、3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性。结论:从本次初步研究看绝大部分的A亚型无α-1、3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性。不同A等位基因其A亚型的抗原性有差别。

疾病所致ABO血型变异及改造研究进展

ABH血型抗原是在红细胞、内皮细胞、上皮细胞表面的糖蛋白或糖脂类蛋白上发现的碳水化合物结构。血型物质的前体H受糖基转移酶的修饰和控制。糖基转移酶是由ABO基因的1对等位基因决定，而红细胞上的H抗原则由FuT1基因控制的岩藻糖基转移酶所决定。A抗原由N-乙酰半乳糖胺修饰H抗原表达；

一例ABO血型A亚型个体的ABO基因序列分析与家系调查

目的分析1例A亚型献血者的ABO血型血清学特性及相关的血型基因。方法用试管凝集法检测样本的ABO血型表型；用尿二苷酸N-乙酰半乳糖胺转移实验确定血型糖基转移酶的活性；用血凝抑制实验检测血型分泌型物质；ABO基因的第6-7外显子序列通过PCR扩增后直接测序分析，并对扩增产物进行克隆测序。结果该例表型为A亚型的先证者为非分泌型，血浆中无α-1、3M乙酰半乳糖基转移酶活性，DNA测序结果显示在第6外显子为nt．261del／G、297A／A，第7外显子为nt．467C／T、806T／C和1009A／G杂合，克隆测序显示一个等位基因为A205，另一个为001等位基因并有nt．806T〉C，该先证者的基因型为A205／Onew（806T〉C）。后者经比对为新的突变，新序列被提交至GenBank（序列号为KP341759）。家系调查结果显示其父亲基因型为Onew（806T〉C）／002，母亲基因型为A101／A205。先证者的新等位基因来自其父亲。结论该标本A抗原性减弱的原因为A205亚型等位基因引起，并存在一个新的O等位基因。

β3GnT8/β3GalT7催化活性的研究

目的进一步验证β1,3半乳糖基转移酶(β3GalT7)的催化功能。方法将重组表达载体pGEX-6p-1-β3GnT8/GalT7转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,得到GST-β3GnT8/GalT7融合蛋白,分别进行β3GalT7和β3GnT8反应体系的酶促反应,利用高效液相色谱(HPLC)进行检测。结果HPLC检测结果表明,β3GalT7同时具有β3GalT7和β3GnT8的活性。结论β3GalT7具有双重酶活性,拟初步重命名为β3GnT8/β3GalT7。

β3GnT8/β3GalT7表达载体构建及其功能

目的探讨β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶/β1,3半乳糖基转移酶(β3GnT8/β3GalT7)与肿瘤浸润、转移的相关性。方法构建并鉴定β3GnT8正义和反义表达载体。将空载体(A组)、正义(B组)及反义(C组)重组载体分别转染人胃癌SGC7901细胞中;另设SGC7901细胞为对照(D)组。采用RT-PCR和Western blot法分别检测四组细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-14和转化生长因子β1(TGF-β1)的mRNA和蛋白表达。结果获得β3GnT8/β3GalT7基因正义和反义表达载体,并成功转染SGC7901细胞。D组TGF-β1、MMP-2和MMP-14表达低于B组,但高于C组。结论β3GnT8/β3GalT7表达与MMP-2、MMP-14和TGF-β1表达呈正相关,故可能参与肿瘤的发生、发展过程。