两株菌对氯氰菊酯及其降解产物3-PBA的协同代谢研究

以两株降解菌为材料,研究了它们对氯氰菊酯及其代谢中间产物3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)的协同降解过程。在有3-PBA存在时,氯氰菊酯降解菌CDT3(Rhodococcus sp.)的生长会受到明显的抑制;低于200mg/L的氯氰菊酯对3-PBA降解菌PBM11(Pesudomonas sp.)的生长无显著影响。同时加入菌株CDT3和PBM11时,氯氰菊酯的降解速率较单独加入菌株CDT3时有所提高。菌株PBM11的菌数随氯氰菊酯和3-PBA的降解而增加,但CDT3的数量没有明显的增加。同时加入菌株CDT3和PBM11的处理中观察不到3-PBA的积累,在后加入PBM11的处理中可观察到24h内明显有3-PBA的积累,加入菌株PBM11后,3-PBA可被迅速降解。

3-PBA降解菌BA3的降解特性及基因工程菌构建

从石油污染土壤中分离到1株能以3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)为唯一碳源生长的细菌,命名为BA3.根据其生理生化特征和16S rDNA序列相似性分析,将该菌鉴定为鞘脂菌属(Sphingobium sp.).该菌株在60 h内对100 mg.L-1的3-苯氧基苯甲酸的降解率达到99%.降解3-苯氧基苯甲酸的最适温度为30℃,pH值为7.0,降解速率与初始接种量呈正相关.拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因pytH为本实验室克隆到的一个新的菊酯水解酶基因,通过PCR从菊酯降解菌株JZ-2总DNA扩增了pytH,将pytH定向克隆到pBBRMCS-5载体上,构建重组质粒pPYTH,在辅助质粒pRK600的帮助下,通过三亲接合将pPYTH转移到3-PBA降解菌株Sphingobium sp.BA3中,获得工程菌Sphingobium sp.BA3-pytH;甲氰菊酯的降解实验表明,菌株JZ-2在48 h内对50 mg.L-1的甲氰菊酯降解率仅为60%左右,工程菌BA3-pytH相同条件下对50 mg.L-1的甲氰菊酯降解率达到95%以上,同时对甲氰菊酯的降解中间产物3-PBA也能较快降解,不会对菊酯的降解产生反馈抑制.工程菌BA3-pytH因其对甲氰菊酯和其降解中间产物3-PBA的快速降解能力,比原始菌株JZ-2在菊酯污染土壤生物修复应用中更具有优势.

HPLC-UV法测定微生物降解体系中3-苯氧基苯甲酸含量

采用高效液相色谱-紫外(high-performance liquid chromatography with ultraviolet,HPLC-UV)法测定微生物降解体系中3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)的含量。以Gemini 100A C18柱(150mm×4.60mm,5.0μm)为色谱柱,乙腈-水(70:30,V/V)为流动相,流速0.7mL/min,用紫外检测器在210nm处检测3-PBA。结果显示:3-PBA对照品的保留时间为4.268min,线性范围为0.5～50.0mg/L,3-PBA平均回收率为98.919%,RSD为2.78%;运用该方法测得4种不同来源的混合菌株发酵液中3-PBA的残留量分别为24.467、86.266、2.633、1.921mg/L。本法简单、快速、准确、分离度好。

基于生物素化纳米抗体检测拟除虫菊酯代谢物3-苯氧基苯甲酸的研究

该研究在前期已制备获得的拟除虫菊酯代谢物3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)纳米抗体(Nb)基础上,将其进行生物素化,并利用多聚辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(polyHRP-SA)进行信号扩增,建立了基于生物素-亲和素系统高灵敏间接竞争ELISA检测3-PBA残留的分析方法。对抗原抗体工作浓度、缓冲液条件(pH值、离子浓度、吐温-20浓度)及polyHRP-SA浓度进行优化后,所建方法对3-PBA的半抑制浓度(IC_(50))为1.7 ng/mL,线性范围为0.37~7.4 ng/mL,检出限(LOD)为0.15 ng/mL。将该方法用于人尿样品(高温酸水解后固相萃取净化)和环境水样品(简单过滤)中3-PBA的检测,加标回收率分别为87.0%~127%和78.0%~113%,相对标准偏差(RSD)不大于10%。该方法具有灵敏度高、操作简便,适用于生物与环境样本中3-PBA的快速筛查。

3-苯氧基苯甲酸纳米抗体免疫磁珠的制备及其鉴定

基于纳米抗体(nanobody,Nb)的免疫磁珠,因其独特的性能在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化等领域受到广泛关注。但目前国内外缺乏对基于Nb与生物源性磁颗粒(bacterial magnetic particles,BMPs)和化学合成的磁颗粒(magnetic particles,MPs)构建的免疫磁珠性能差异的研究。本研究以3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)Nb作为研究对象,通过基因工程技术在其C-端引入半胱氨酸(cysteine,Cys),获得Nb-6His-Cys重组蛋白质。利用双功能交联试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)将Nb-6His-Cys分别与BMPs和MPs进行偶联获得免疫磁珠,评价2种免疫磁珠的性能差异。结果表明,SPDP能够分别将Nb-6His-Cys定向固定在BMPs和MPs表面上;磁珠表征发现,BMP-Nb的水合粒径、电位和分散性均优于MP-Nb(BMP-Nb的水合粒径为68.43±24.54,电位-27.89 mV,分散性0.57;MP-Nb的水合粒径为27.31±5.28,电位-26.12 mV,分散性0.44);通过差值法计算发现,BMPs可展示更多的Nb-Cys(1 mg的BMPs上能够展示697±16μg 3-PBA Nb-Cys,1 mg的MPs上能够展示569±18μg 3-PBA Nb-Cys)。综上研究表明,Nb和BMPs构建的免疫磁珠性能优于Nb和MPs构建的免疫磁珠,本实验为合理选择免疫磁珠检测方法提供了理论依据,为实现3-PBA的环境快速检测提供物质支撑。

氯氰菊酯污染土壤的微生物修复及对土著微生物的影响

在实验室条件下,在含有氯氰菊酯的土壤中添加氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)降解菌CDT3(Rhodococcussp.)和PBM11(Pesudomonassp.),同时设不加菌的对照。分别于0、3、7、15、30 d取样,测定土壤中氯氰菊酯和3-PBA的残留,同时用平板计数和变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法分析土壤微生物群落的变化。结果显示:CDT3和PBM11在土壤中协同作用能够更好地降解氯氰菊酯及其中间产物3-PBA。氯氰菊酯对土著微生物有较强的抑制作用。投加降解菌可以消除农药对土壤微生物的抑制,有助于土著微生物种群的恢复,但短期内无法改变农药对土壤微生物结构的破坏。

微生物降解3-苯氧基苯甲酸的研究进展

3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)作为大多数拟除虫菊酯类农药的降解产物之一,在自然环境中难以降解,具有雌激素毒性,严重威胁到食品安全及人体健康。微生物对拟除虫菊酯及其中间产物(3-PBA)的降解已成为近年来的研究热点。本文从降解3-PBA的微生物种类、降解酶及降解基因、降解途径等方面进行了综述,对3-PBA生物降解机理、3-PBA降解酶基因工程菌构建的研究方向进行了展望,以期为微生物降解3-PBA的研究提供参考。

氯氰菊酯降解菌株L12的分离鉴定及降解特性

【目的】通过分离纯化氯氰菊酯降解菌,研究降解特性为实际应用提供理论依据。【方法】利用富集驯化培养技术分离菌株,通过形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析鉴定菌株。测定培养液中氯氰菊酯的浓度和代谢产物以及菌体细胞的密度和细胞表面疏水性,研究菌株的降解特性。【结果】从生产氯氰菊酯的农药厂污水曝气池中,分离到1株能降解氯氰菊酯并以之为唯一碳源进行生长的细菌菌株L12。16SrRNA基因序列相似性比较表明,分离出的菌株与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的相似性高达99%。以初始浓度为50 mg/L的氯氰菊酯为唯一碳源时,5 d内菌株对氯氰菊酯的去除率为85.6%;薄层层析分析表明,在Rf0.13处有代谢产物产生,经HPLC分析发现其与3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)的保留时间一致(2.26min);采用微生物粘着碳烃化合物法(MATH)对该菌株的细菌表面疏水性进行测定,结果表明,菌株L12的细胞表面疏水性最高为68.91%。【结论】分离出的氯氰菊酯降解菌属于Bacillus cereus菌株,该菌株对氯氰菊酯具有较高的降解能力,同时产生代谢产物3-PBA,而且具有较高的细胞表面疏水性。

职业接触拟除虫菊酯工人精子浓度的调查

目的调查拟除虫菊酯暴露与工人体内氧化应激状态和精子浓度的关联性,为制定拟除虫菊酯职业暴露引起男性职业性生殖毒性损害的诊断标准提供依据。方法2020年9—10月,选取武汉市某拟除虫菊酯类农药工厂一线岗位234名成年男性工人为暴露组,117名成年男性行政后勤人员为对照组,收集调查对象的一般人口学信息并采集尿液5 mL,检测尿中3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)、8-羟氧基苯甲酸(8-OHdG)浓度;采集调查对象禁欲3 d后的精液,测量精子浓度。同时检测该工厂生产工人主要接触的化学有害因素浓度。结果生产工人主要接触的化学有害因素为:溴氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯和顺式氯氰菊酯。暴露组人员的3-PBA浓度、8-OHdG浓度均高于对照组,精子浓度低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。经Person相关性检验,351名研究对象3-PBA浓度与8-OHdG浓度呈正相关(r=0.511,P<0.01),与精子浓度呈负相关(r=-0.546,P<0.01);8-OHdG浓度(经自然对数转换)与精子浓度呈负相关(r=-0.113,P<0.05)。线性回归模型分析结果显示:(1)尿中3-PBA浓度(经自然对数转换)每增加1μg/g,8-OHdG浓度增加7.362μg/g,精子浓度减少0.136×10^(8)个/mL;(2)BMI每增加1 kg/m2,8-OHdG浓度增加0.396μg/g,精子浓度减少0.014×10^(8)个/mL。未观察到年龄、吸烟、饮酒与8-OHdG浓度、精子浓度之间的剂量-效应关系。结论拟除虫菊酯暴露可能会升高男性职业接触人群氧化应激水平,降低精子浓度,应加强工人的职业防护。