细菌3–酮脂酰ACP还原酶的研究现状与展望

3–酮脂酰ACP还原酶属于短链醇脱氢酶/还原酶(SDR)超家族蛋白,参与细菌脂肪酸及相关物质合成,负责催化3–酮脂酰ACP还原为3–羟脂酰ACP。3–酮脂酰ACP还原酶在细菌中广泛存在,且氨基酸序列较为保守,然而其生物学功能却展现出多样性。本文对近年来细菌3–酮脂酰ACP还原酶的结构特性、生物学功能和抑制剂等方面的研究进展进行综述,为加深对3–酮脂酰ACP还原酶的理解和抗菌药物的开发提供有益的借鉴。

恶臭假单胞菌中3-酮脂酰ACP还原酶FabG5是脂肪酸合成关键酶

3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化脂肪酸合成中的第一步还原反应,是细菌生长的关键酶之一.恶臭假单胞菌在环境污染治理和工业聚羟基脂肪酸(PHA)的生产中,都具有重要的应用价值.生物信息学分析显示,恶臭假单胞菌基因组编码6个FabG同源蛋白质,与大肠杆菌FabG相比较,PpFabG5序列相似性最高(76.5%),其他几个PpFabG也都具有较高的序列相似性(约50%).除PpFabG4之外,其他的同源蛋白质都具有催化活性位点和N端辅因子结合位点.为研究恶臭假单胞菌中这6个FabG同源蛋白质的生物学功能,本文进行了异体遗传互补、体外酶学活性分析、体内基因敲除与突变株性状分析等研究.结果显示,只有PpfabG1、PpfabG3、PpfabG5能恢复大肠杆菌fabG温度敏感突变株CL104在42℃时生长,其中PpfabG1互补株生长较弱.而在体外活性检测中,PpFabG1、PpFabG3和PpFabG5在脂肪酸合成起始反应和延伸反应中都具有催化活性,但PpFabG1活性较弱,PpFabG6仅在起始反应中具有催化活性. PpfabG5是恶臭假单胞菌生长的必需基因,不能被敲除,而其他几个PpfabG基因敲除后不影响菌体的生长,突变株的脂肪酸组成与野生菌也无差异.但PpfabG1、PpfabG2敲除后菌体的运动性下降,PpfabG3、PpfabG6突变影响了生物被膜的合成量,而PpfabG4、PpfabG6敲除突变株对H2O2的耐受性增强,表明这些基因具有不同的生理功能,可能在菌体的不同逆境中发挥作用.

大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶110位天冬酰胺突变后的结构与功能

3-酮基脂酰ACP还原酶催化3-酮基脂酰ACP还原为3-羟基脂酰ACP,是细菌脂肪酸合成反应的关键酶之一.为了明确该酶中110位的保守天冬酰胺残基在酶催化活性和酶结构中的作用,本研究采用基因定点突变和蛋白质表达纯化技术,获得了大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶FabG的两个突变蛋白:FabG N110Q和FabG N110L.圆二色谱结果显示,天冬酰胺残基的突变改变了FabG的空间结构,使突变蛋白的α螺旋结构明显增加.以3-酮脂酰ACP为底物的酶活性测定表明,突变蛋白的酶活性均有下降,但残存的酶活性达到了FabG的75%以上.突变蛋白FabG N110Q和FabG N110L具有3-酮基脂酰ACP还原酶的活性,能在体外重建细菌脂肪酸合成反应.对fabG温度敏感突变株的遗传互补分析表明,FabG蛋白110位天冬酰胺突变为谷氨酰胺或亮氨酸后,在一定的条件下仍能互补大肠杆菌的生长.本研究结果提示,FabG 110位的天冬酰胺残基不是参与3-酮基脂酰ACP还原酶催化反应的必需氨基酸,它只是作为结构氨基酸,在维持FabG的空间结构的稳定性方面起作用.

水稻白叶枯病菌FabG同源蛋白生物信息学分析

【目的】拟运用生物信息学的方法对目标基因进行预测分析,为后续展开水稻白叶枯病菌FabG及脂肪酸代谢途径的实验室研究提供参考。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)FabG(EcFabG)序列,在Xoo PXO99^(A)菌株基因组中经同源性比对发现,PXO_03085、PXO_00989、PXO_03629、PXO_02411、PXO_02878、PXO_02709所编码蛋白与大肠杆菌FabG具有同源性,将该6个基因分别命名为XoofabG1~XoofabG6,并将其编码蛋白命名为XooFabG1~XooFabG6。进一步运用生物信息学在线分析软件对这6个蛋白与EcFabG进行了理化性质、蛋白结构、亲水性、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点及蛋白相互作用网络方面进行预测分析。【结果】6个蛋白(XooFabG1~XooFabG6)在理化性质、亲水性和信号肽方面区别较大,其中XooFabG1是一个不稳定蛋白,属于短链脱氢酶家族,具有酮脂酰ACP还原酶活性,但蛋白稳定性差,很可能与细菌应激状态下的反应有关。XooFabG3被标注为3-酮脂酰ACP还原酶,与EcFabG相比,功能相差较大,推测与辅因子和维生素的代谢相关。XooFabG5具有酮脂酰ACP还原酶结构域(KR domain),但该结构域在蛋白质序列中所处位置与EcFabG相比差异较大,推测其催化底物可能与EcFabG不同。XooFabG6在各方面的性质与EcFabG最接近,推测XooFabG6为3-酮脂酰ACP还原酶并参与脂肪酸合成代谢。但XooFabG2和XooFabG4的功能还不明确。【结论】本文通过预测分析黄单胞菌水稻致病变种中6个同源蛋白的特性,推测了其中4个蛋白可能具有的功能,对研究Xoo的脂肪酸合成途径具有一定意义。

恶臭假单胞菌SJTE-1中转化17β-雌二醇的3-酰基-ACP还原酶的鉴定与功能研究（英文）

【目的】假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚。本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究。【方法】首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白。体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物。【结果】3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6mg/L。蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基。该酶以NAD+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L, kcat值为2.4±0.06/s–1,5 min内可转化超过95.8%的雌二醇。该酶的最佳反应温度为42°C,最佳pH为8.0。不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg2+和Mn2+可增强其酶活性。【结论】这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用。