水稻SIDP301基因的克隆与功能分析

水稻是一种重要的粮食作物,也是单子叶植物研究的模式植物,其抗逆相关基因的克隆与功能分析具有重要的理论和现实意义.水稻SIDP301基因编码的蛋白质含有DUF1644家族保守结构域和锌指结构域.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)数据表明SIDP301基因在水稻各个组织中均有表达,其中在根和叶中表达水平较高.SIDP301基因的表达受高盐、高温和茉莉酸诱导.与对照相比,超量表达转基因植株的耐盐性不明显,而抑制表达转基因植株对高盐较敏感.进一步用qRT-PCR检测抗逆相关标记基因,结果表明P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1在超量表达转基因植株中的表达量高于野生型植株,而在抑制表达转基因植株中这些基因的表达变化不明显.上述结果说明SIDP301是一个抗逆相关基因,其表达量受抑制时会降低水稻的抗逆性.

棉花抗枯萎病相关GhB301基因对烟草的遗传转化及功能分析

【目的】ERF是乙烯信号传导途径中的重要转录因子,在植物与病原菌互作中发挥着重要的调控作用。棉花抗枯萎病相关Gh B301基因是从棉花中获得的ERF-B3亚组基因,探索该基因在烟草异位表达后的功能,为进一步研究其在棉花抗枯萎病中的功能奠定基础。【方法】以p PZP35S表达载体为基础,构建Gh B301的过表达载体;采用农杆菌介导法转化烟草并获得转基因植株。【结果】经卡那霉素筛选、PCR和RT-PCR检测,获得3株转基因阳性植株;q PCR分析显示,转基因阳性植株中部分病程相关蛋白基因的表达量较野生型明显升高。【结论】棉花抗枯萎病相关基因Gh B301在烟草中异位表达后可能会通过增强部分病程相关蛋白基因的表达来提高植株抗病性。

转GhB301基因烟草的防御酶活性及抗病相关基因表达分析

为了明确棉花ERF-B3亚族转录因子基因GhB301在烟草异位表达后(抗枯萎病中)的功能,该研究以过表达GhB301基因烟草和野生型烟草为材料,采用枯萎病菌孢子悬浮液接菌方法,分析病原菌侵染前后防御酶活性变化以及防卫相关基因的表达变化与抗病性的关系。结果显示:(1)棉花枯萎病菌处理15 d后,2个转基因株系烟草叶片黄化程度与野生型相比较轻。(2)棉花枯萎病菌处理后,过表达GhB301转基因烟草和野生型烟草叶片过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)的活性较未接菌对照显著提高,并且酶活峰值出现均早于野生型材料;转基因材料叶片的POD、PAL、PPO活性均在处理3 d后达到峰值,而野生型材料叶片的POD、PAL活性在处理5 d后才达到峰值。(3)接种棉花枯萎病菌后活性氧相关基因、乙烯(ET)/茉莉酸(JA)途径相关基因、病程相关基因的表达量在转基因株系OE1和OE2中均受到明显影响。研究推测,GhB301在烟草中的异位表达激活了防卫相关基因的表达,提高了防御酶的活性,从而增强了烟草对枯萎病菌的抗性。

转GhB301基因棉花响应枯萎病菌侵染的转录组分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factor,ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制,本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系,通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理,抗病性鉴定结果表明,过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性,其病情指数为14.77,显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48 h后,利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析,共得到273111170个clean reads,其Q30均大于87.64%,将clean reads与陆地棉参考基因组TM-1比对,获得了14021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比,转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程,67个DEGs参与防御反应,31个DEGs参与苯丙烷类生物合成,推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。

转GhB301基因棉花抗枯萎病机理研究

为了明确棉花AP2/ERF转录因子基因GhB301在抗枯萎病中的功能,以过表达GhB301转基因棉花纯合株系(OE)与野生型对照YZ-1(WT)为材料接种枯萎病菌,研究接菌后不同棉花材料叶片中防御酶活性变化及抗病相关基因的表达差异。结果显示:接菌后0~7 d,随着接菌时间的延长,棉花叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)活性逐渐增高,均呈先增加后降低的变化趋势,但转基因株系中酶活性提高的更快、峰值更高;接种棉花枯萎病菌24 h后,测定各材料中苯丙烷代谢途径(GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhHCT1、GhF5H2、GhCCR1)、JA/ET路径(GhAOC1、GhAOS1、GhEIN2、GhERF1、GhJAZ1)、SA路径(GhICS1、GhEDS1、GhPAD4、GhNPR1)、PR基因(GhPR1、GhPR2、GhPR4、GhPR5)等抗病相关基因的相对表达量,除GhERF1、GhJAZ1、GhNPR1外其余均在转基因株系中上调表达。推测在棉花中过表达GhB301基因提高了防御酶活性和抗性基因的表达,从而增强棉花对枯萎病的抗性。

基因脉冲导入仪在电化学疗法中的应用

本文介绍了电化学疗法的原理和天津理工大学自行研制的基因脉冲导入仪LN-301的系统组成。在此基础上,利用基因脉冲导入仪LN-301及配套的针电极在小鼠身上进行了电化学疗法实验。通过电化学疗法对接种有S180的小鼠进行对比实验。实验结果表明:应用抗癌药物环磷酰胺(CTX)和博莱霉素(BLM)的ECT组的抑瘤率分别为60.9%和70.4%,与传统的治疗方法相比抑瘤率显著提高。

基于TaqMan探针非洲猪瘟病毒E301R基因荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立基于TaqMan探针的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)E301R基因荧光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法,并进行验证,以期应用于临床样本中ASFV的检测。方法通过对ASFV E301R基因序列进行分析,选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针。PCR扩增E301R基因片段,克隆至pCAGGS载体,构建质粒标准品,建立基于TaqMan探针的qPCR检测方法,并验证方法的线性范围、精密性、特异性、敏感性及准确性。采用建立的方法检测92份临床样本,并与商品化ASFV荧光PCR试剂盒检测结果进行比较。另采用建立的方法对E301R基因转录动力学进行分析。结果质粒标准品在1.6×(10^(1)~108)拷贝/μL范围内,与Ct呈良好的线性关系,线性回归方程为:y=-3.239 x+40.774,R2=0.994;重复性及中间精密性验证CV均<2%;除ASFV外,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)均未出现扩增曲线;最低可稳定检出1.6×10^(1)拷贝/μL的质粒标准品;浓度为1.6×10^(2)和1.6×10^(1)拷贝/μL质粒标准品的加标回收率在90%~110%之间。建立的方法与商品化ASFV荧光PCR试剂盒对92份临床样本检测结果的符合率为96.7%(Kappa=0.932,P=1.000)。E301R基因可能为ASFV感染的中期转录基因。结论建立的基于TaqMan探针的qPCR检测方法具有良好的精密性、特异性、敏感性及准确性,可用于临床样本中ASFV的检测。

抗玉米螟基因Cry1A.301原核表达和玉米遗传转化

增强玉米品种的抗虫性是减少玉米螟为害、提高玉米产量的有效途径。通过密码子优化改造获得抗虫基因Cry1A.301,构建原核表达载体pET30a-Cry1A.301,进行蛋白免疫学、ELISA检测以及玉米螟抗性生测。结果表明,原核表达载体中Cry1A.301蛋白高效表达,且7d后杀虫效率达100%。通过Cry1A.301基因与植物表达载体CPB连接,构建CPB-35S∶∶Cry1A.301-35S∶∶bar载体进行农杆菌介导的玉米萌动胚遗传转化,得到12株T0代转基因植株。T0代植株叶片中目的基因、筛选标记bar基因的PCR检测与蛋白免疫学检测结果表明,Cry1A.301基因已经整合到玉米基因组并表达。