基于P32蛋白的山羊痘病毒抗体荧光微球检测方法的建立

为建立一种山羊痘病毒(GTPV)抗体快速检测方法,试验将携带GTPV结构蛋白P32基因的重组质粒pET28a-P32转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后获得了重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明该蛋白具有良好的特异性和反应原性。以荧光微球为标记材料对P32蛋白进行标记,通过优化反应条件制备了快速检测GTPV抗体的荧光微球免疫层析试纸条,并对其性能进行评价。结果:该试纸条与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)的阳性血清均无交叉反应;阳性血清稀释至800倍仍能检出阳性,敏感性较高;批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,稳定性较好;与ELISA检测方法对比的总符合率为92.5%。综上,本试验建立的荧光微球试纸条可用于GTPV抗体的快速检测和流行病学调查。

牛结节性皮肤病病毒P32蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为原核表达牛结节性皮肤病病毒(LSDV)P32蛋白并制备其多克隆抗体,本研究基于GenBank中LSDV-P32基因序列,使用多种生物信息学工具对P32蛋白的理化性质及生物学特性进行分析,选择富含B细胞表位的区段连接至pCold-TF载体,优化表达条件,重组蛋白纯化后利用SDS-PAGE和Western blot鉴定。将纯化后的P32蛋白免疫獭兔,制备多克隆抗体,利用ELISA、IFA和Western blot对多克隆抗体进行特性鉴定。结果显示:本研究利用原核表达系统成功表达了可溶性LSDV-P32蛋白,最佳表达条件为诱导温度15℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L、摇床转速120 r/min、诱导时间30 h;制备的兔源多克隆抗体ELISA效价可达1∶409600,可应用于ELISA、Western blot和IFA试验。本研究为LSDV-P32蛋白功能的研究及相关检测试剂研发提供了一定技术支撑。

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物, 对CaPV P32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969 bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD／ Thio-TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPV P32基因序列的同源性高达99％;相应地,氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经 L-arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPV P32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约 51．53 ku。

羊痘病毒P32蛋白基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

应用PCR方法扩增羊痘病毒特异性蛋白P32蛋白的基因 ,将其克隆至pMD18_T载体 ,测定核酸序列后将P32基因克隆至Bac_to_Bac○R杆状病毒表达系统中转移载体pFastBac1和pFastBacHTa ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,获得两种携带P32基因的重组转染质粒 :Bacmid_Bac1_P32 ,Bacmid_BacHT_P32 ,经PCR试验鉴定 ,获得的这两种重组转染质粒是携带P32基因的杆状病毒表达载体 。

羊痘病毒P32蛋白的研究进展

P32蛋白是所有羊痘病毒具有的结构蛋白之一,含有重要的免疫原性决定簇。P32蛋白既是致病的关键因素,也是激发机体产生抗体并产生保护性免疫的主要成分。作者就羊痘病毒P32蛋白的基因组结构、抗原表位及P32蛋白应用于羊痘病毒诊断和免疫方面的研究进展作一综述。

异动症大鼠直接通路中DARPP-32蛋白变化的机制

目的:观察左旋多巴诱发异动症(LID)大鼠模型行为学特点及DARPP-32蛋白的磷酸化状态的变化,探讨LID的发生机制。方法:复制成功的帕金森病(Parkinson′sdisease,PD)大鼠应用左旋多巴治疗28d诱发LID大鼠模型,进行异常不自主运动(abnormalinvoluntarymovement,AIM)评分,并采用逆转录聚合酶链式反应及免疫印迹技术检测LID大鼠纹状体内总DARPP-32的mRNA与蛋白表达及其Thr-34位点磷酸化水平。结果:LID大鼠模型复制成功后出现了与人类LID相似的对侧前肢、躯干和口面部AIM,并随左旋多巴治疗时间的延长而加重。LID大鼠Thr-34位点磷酸化的DARPP-32水平较对照组及左旋多巴治疗组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.01)。结论:长期间断性给PD大鼠左旋多巴能复制出LID大鼠模型,DARPP-32的Thr-34位点的磷酸化水平的改变是LID时多巴胺D1受体介导的直接通路异常活化的关键因素之一。

异动症大鼠模型基底节DARPP-32蛋白磷酸化状态的变化

目的观察左旋多巴诱发异动症(LID)大鼠模型行为学特点及DARPP-32蛋白的磷酸化状态的变化,探讨LID的发生机制。方法复制成功的帕金森病(Parkinson disease PD)大鼠应用左旋多巴治疗28d诱发LID大鼠模型,进行异常不自主运动(abnormalinvol untary movement,AIM)评分,并采用免疫印迹技术检测LID大鼠纹状体内DARPP-32蛋白Thr-34位点磷酸化水平。结果LID大鼠模型复制成功后出现了与人类LID相似的对侧上肢、躯干和口面部异常不自主运动(AIM),并随左旋多巴治疗时间的延长而加重。LID组大鼠纹状体内Thr-34位点磷酸化的DARPP-32水平较对照组与左旋多巴治疗组明显增高,又以重度LID组大鼠更为显著,差异有显著性意义(P<0.01)。结论慢性间断性给PD大鼠左旋多巴能复制出LID大鼠模型,其纹状体区DARPP-32蛋白的磷酸化状态发生了改变,与LID的发生可能有关。

抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在10^5以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。

山羊痘病毒P32蛋白的原核表达及其免疫原性研究

为表达山羊痘病毒P32蛋白并研究其免疫原性,构建了含有P32基因的重组表达质粒p ET-P32,诱导表达和纯化了P32蛋白;分别运用SDS-PAGE和Western blot,对该蛋白进行了分析和生物活性鉴定;用分析鉴定后的P32蛋白免疫BALB/c小鼠,然后采集小鼠血清,用间接ELISA进行抗体检测;用小鼠脾淋巴细胞增殖试验,检测该蛋白对机体的细胞免疫活性。结果显示:表达纯化的含有GST标签的P32重组蛋白,大小约39k Da;Western blot显示P32重组蛋白具有较好的特异性;间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明P32重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验结果为深入研究P32蛋白的生物学功能以及对山羊痘的诊断与防治奠定了基础。

重组羊痘病毒P32蛋白的真核表达与间接ELISA检测方法的建立

为探索敏感性高、特异性强、高通量、操作简便的羊痘病毒(CaPV)检测方法,将编码CaPV P32抗原的核苷酸序列优化为适合在Sf9细胞中表达的偏好密码子,去除氨基酸序列跨膜区,优化蛋白表达条件,利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达出了重组CaPV P32蛋白,建立了检测CaPV血清抗体的间接ELISA方法。建立的间接ELISA方法对相关的羊类病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:1024,组内和组间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA方法,对480份临床血清样品进行抗体检测并与血清中和试验进行比对,发现两种方法的敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。本研究建立的CaPV P32血清抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可进一步开发为商品试剂盒,用于现场高通量检测,具有较好的市场应用前景。

Gene32蛋白对PCR产量的影

在临床检测和科研中，有时因引物对原因，ＰＣＲ产量低，不利于结果观察。在ＰＣＲ检测血清ＨＢＶ基因的同时，加入Ｇｅｎｅ３２蛋白，提高了ＰＣＲ产量和灵敏度。１材料与方法１．１基因３２蛋白（Ｇｅｎｅ３２ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），２．５ｍｇ／ｍｌ...

人PBMCs内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1辅受体抑制作用的研究

目的:在人PBMCs内表达CCR5Delta32蛋白,研究其对细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4的抑制作用。方法:构建pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMCs,Western blot检测目的蛋白的表达。继续培养靶细胞,FACS分析细胞表面CCR5和CXCR4分子的变化。结果:成功构建了pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMCs,Western blot检测到目的蛋白的表达。FACS分析表明,靶细胞内目的蛋白的表达对靶细胞表面辅受体CCR5和CXCR4的产生起抑制作用,抑制率在转染后第6天达到高峰(CCR5的抑制率为51.69%,CXCR4的抑制率为61.05%)。结论:靶细胞内目的蛋白的成功表达及其对靶细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4产生的抑制作用,为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

基于ANP32蛋白的B型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备

为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒与表达鼠muANP32B(111-C)-flag的质粒共转染ANP32A/ANP32B双敲除的293T细胞(DKO细胞),36 h后通过免疫沉淀(IP)试验,富集并纯化RdRp(由PB1、PB2、PA亚基组成),经SDS-PAGE检测获得了纯度较高的ANP32B(111-C)-RdRp复合物。以纯化的该复合物免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选能稳定分泌IBV RdRp和ANP32B(111-C)特异性MAb的杂交瘤细胞株。利用western blot鉴定各杂交瘤细胞株分泌MAb所结合的RdRp亚基。从获得的各种MAb中分别选取效价最高的1株制备小鼠腹水,利用间接ELISA方法测定各腹水的效价。将表达A、B、C、D型流感病毒RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒分别转染293T细胞,24 h后裂解细胞,利用所制备的RdRp各MAb经western blot鉴定其交叉反应性;分别将表达不同物种ANP32B蛋白的质粒转染DKO细胞,24 h后利用制备的muANP32B(111-C)MAb经western blot鉴定。上述试验结果显示,共筛选到27株阳性杂交瘤细胞。Western blot结果显示,获得了多株稳定分泌PB1亚基、PB2亚基、PA亚基及muANP32B(111-C)MAb的杂交瘤细胞株;间接ELISA结果显示,上述各类MAb制备的小鼠腹水最高效价为1:1.28×10^(5)~1:6.4×10^(4),分别命名为1D10、1E9、2E9、6C7。Western blot结果显示,制备的IBV RdRp各单亚基MAb均能与IBV RdRp对应单亚基蛋白发生特异性反应,而不与A、C、D型流感病毒RdRp对应的单亚基反应,表明各MAb对IBV的特异性较强;其中MAb 6C7可以识别鼠、人、鸡、牛、猪、犬的ANP32B蛋白及鸡的ANP32A蛋白,表明该MAb的物种广谱性较好,可用于不同物种ANP32蛋白的检测。将MDCK细胞感染IBV,并分别以转染IBV RdRp各亚基质粒的293T细胞作为阳性对照;培养鼠源SP2/0细胞,并以转染muANP32B质粒的DKO细胞作为阳性对照,利用制备的MAb分别经激光共聚焦试验检测病毒RdRp各亚基在MDCK细胞及muANP32B在SP2/0细胞中的定位。结果显示,各MAb均能够与细胞中病毒RdRp各单亚基及SP2/0细胞中的内源性muANP32B蛋白反应,出现相应荧光。且PB1、PA亚基及内源性muANP32B主要定位在细胞质,PB2亚基主要定位在细胞核。本研究首次利用ANP32(111-C)蛋白富集IBV RdRp,并采用免疫ANP32(111-C)-RdRp复合物的方式同时获得了针对IBV RdRp 3个亚基和ANP32(111-C)蛋白的4株MAb,且能识别出多种与IBV感染相关的关键互作蛋白,可为IBV相关研究及检测提供有效的技术支持。

结核分枝杆菌CFP32蛋白的原核表达及其细胞免疫学检测价值评价

目的克隆、表达与纯化结核分枝杆菌CFP32蛋白,并对其进行细胞免疫学特性评价。方法 PCR扩增cfp32基因片段,与pET-30a(+)构建重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,对融合蛋白进行纯化,ELISPOT试验测定其细胞免疫应答,通过牛结核外周血IFN-γ释放试验,评价其作为刺激原的能力。结果构建了正确基因序列的重组质粒,并在BL21(DE3)中高效可溶性表达,融合蛋白大小为32ku,纯度达91.8%。ELISPOT显示CFP32蛋白刺激机体分泌IFN-γ和IL-4的细胞数相当,呈现Th1/Th2的平衡。在牛结核外周血IFN-γ释放试验中,其阳性符合率和阴性符合率分别为40%和73.3%,与牛型PPD刺激结果的相关系数为0.684。结论成功构建CFP32蛋白重组表达菌,该蛋白引起的免疫应答趋向于Th1/Th2的平衡,并且有作为刺激原用于牛结核病检测的潜力。

牛结节性皮肤病病毒p32蛋白膜外区可溶性表达及多克隆抗体制备

为获得牛结节性皮肤病病毒(LSDV)p32可溶性蛋白并制备其多克隆抗体,截取了LSDV的P 32基因膜外区序列,并构建了重组表达质粒pColdⅠ-P32,在大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS细胞中经低温诱导表达,然后用钴离子亲和层析纯化以可溶性形式表达的重组蛋白,使用纯化的p32截短蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,并通过Western blot鉴定。结果表明,成功使用钴离子亲和层析纯化获得LSDV p32可溶性膜外区蛋白,制备的多克隆抗体可以特异性识别LSDV感染的牛组织蛋白。获得的纯度较高的LSDV p32截短蛋白和特异性良好的多克隆抗体,为建立LSDV抗原检测方法及亚单位疫苗的研制奠定了基础。

犬ANP32蛋白多态性及其对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响

【目的】探索犬酸性核磷蛋白32(canis acidic(leucine-rich)nuclear phosphoprotein 32 ku,caANP32)对不同物种A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)RNA聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因(caANP32A、caANP32B及caANP32E)的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05;P<0.01),在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因(P<0.01;P<0.05),在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异(P>0.05)。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接变体:caANP32B_X1、caANP32B_X2和caANP32B_X3;caANP32E基因具有2个不同剪接变体:caANP32E_X1和caANP32E_X2。通过分析ANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响发现,caANP32A和caANP32B均能支持犬流感病毒(H3N2_(GD11))和马流感病毒(H3N8_(JL89))RNA聚合酶活性,而对禽流感病毒(H9N2_(ZJ12))RNA聚合酶活性支持较低。caANP32B_X2剪接变体对哺乳动物流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力显著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3(P<0.05);而caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性。【结论】本研究初步解析了caANP32家族蛋白的组织分布及序列多态性,阐明了其对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用,为解析MDCK细胞作为流感病毒分离和疫苗生产细胞系的分子机制提供了新的借鉴。

紫草素对Cx32蛋白组成的细胞缝隙连接功能的影响

目的探究紫草素对宫颈癌Hela细胞缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)和缝隙连接蛋白32(Cx32蛋白)表达水平的影响。方法将细胞分成两组培养,加多西环素为诱导组,不加多西环素为非诱导组,采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测不同浓度紫草素对Hela细胞毒性的影响;采用细胞接种荧光示踪法(parachute assay)观察不同浓度紫草素对缝隙连接(gap junction,GJ)功能的影响;采用蛋白免疫印迹法(western-blot)研究紫草素在影响GJ功能浓度范围内对Cx32蛋白表达的影响。结果紫草素在0~4μmol/L浓度时对非诱导组Hela细胞无毒性作用;紫草素在0~3μmol/L浓度时对诱导组Hela细胞无毒性作用;诱导组细胞在紫草素1~3μmol/L浓度时荧光传递量会随浓度增加;紫草素(1~3μmol/L)能浓度依赖性增强GJ功能及Cx32蛋白表达量。结论紫草素能够增强Cx32组成的细胞GJ功能,这种增强作用可能与其增加Cx32蛋白表达水平有关。

新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。

基于山羊痘病毒P32蛋白间接ELISA方法的建立

通过Ni柱亲和层析和G-100层析技术对真核表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析GPV P32蛋白纯化效果;应用琼脂扩散试验检测纯化蛋白的抗原反应性,并以纯化蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。结果显示,从真核表达产物中获得了纯化的GPV P32蛋白,琼脂扩散试验显示纯化的GPV P32蛋白具有良好的抗原反应性;基于纯化蛋白建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。结果表明,本试验建立的间接ELISA方法可用于山羊痘流行病学的调查和血清抗体水平的监测,为山羊痘的防控提供了有效技术。

酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B对肺癌细胞增殖、迁移、凋亡的影响

目的探究酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B(acidic leucine⁃rich nuclear phosphoprotein 32B,ANP32B)在肺癌(lung cancer,LC)中的作用机制。方法利用TCGA公共数据库,分析肺癌组织中ANP32B的表达情况。通过Kaplan⁃Meier Plotter生物信息数据库,检索分析ANP32B表达与患者预后的关系。通过体外细胞实验检测ANP32B在肺癌细胞及正常肺上皮细胞的表达差距。在肺癌细胞系中沉默ANP32B的表达水平,利用平板克隆实验计数细胞克隆团数目,利用划痕实验观察伤口愈合情况。Western blot检测ANP32B对通路蛋白的影响。结果通过TCGA数据库分析发现ANP32B在肺癌组织中表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001);通过Kaplan⁃Meier Plotter生物信息数据库发现ANP32B高表达的肺癌患者的总体生存期(overall survival,OS)较短(P<0.001)。通过体外细胞实验证明ANP32B在肺癌细胞的表达量高于正常肺上皮细胞。沉默ANP32B后,肺癌细胞增殖较对照组明显减慢(P<0.01),迁移能力明显下降(P<0.001)。ANP32B沉默后,凋亡相关蛋白Cleaved⁃Caspase3明显下调。结论ANP32B在肺癌组织及肺癌细胞系中高表达。沉默ANP32B表达水平后,可明显抑制A549细胞增殖、迁移。ANP32B可能抑制A549细胞的凋亡。