利用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响

本试验以茄病镰刀菌(Fusarium solani)为研究对象,探索了Hoechst 33342及PI荧光染剂对病菌不同活性孢子的色泽差异,明确了病原菌经Hoechst 33342染色后的活孢子发蓝色荧光,最佳染色浓度和时间为1μg/mL、20 min;碘化丙啶(PI)染色后的死孢子发红色荧光,最佳染色浓度和时间为3μg/mL、10 min。并由此建立了Hoechst 33342-PI荧光双染技术,应用该技术可快速、清晰地甄别出不同浓度氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活性和萌发的影响,结果表明,氰氨化钙对茄病镰刀菌的灭杀效果随着浓度增高而增强,且与处理时间呈正相关。2000 mg/L氰氨化钙处理3 h,孢子致死率高达83.97%;500~1000 mg/L处理3 h,孢子致死率为7.15%~26.80%,孢子萌发率为2.40%~3.59%,处理48 h时,孢子致死率达92.07%~100%。250 mg/L氰氨化钙对茄病镰刀菌的致死效果微弱或没有影响。本研究通过菌丝速率法和生物量法进一步验证了应用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响是可行的。这为突破植物病原微生物药剂室内常规筛选方法提供了新的思路和技术手段。

Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色技术检测神经细胞凋亡的对比研究

目的：利用Hoechst33342/PI双染法和原位末端标记法（TUNEL染色检测纳米二氧化硅（nm-SiO2）对神经细胞凋亡的影响，比较两种检测方法的优缺点。方法：以体外培养的人神经母细胞瘤SK-N-SH为研究对象，15和30 nm粒径的nm-SiO2（剂量为2.5、5、10μg/mL）分别处理细胞24 h，另设1-5 m SiO2组和溶剂对照组，采用Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色检测各处理组对SK-N-SH细胞凋亡的影响。结果：与对照组相比，两种检测方法分析均显示了nm-SiO2处理组SK-N-SH细胞凋亡率显著增加（P〈0.05），且具有尺寸、剂量依赖性，而微米级SiO2对凋亡的影响不显著（P〉0.05）。结论：nm-SiO2能诱导SK-N-SH细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染法特异性高，简单易行；TUNEL法灵敏度高，能检测少量的细胞凋亡，但成本较高，两种方法可结合使用以便更加准确的检测神经细胞的凋亡。

SYBR-14/PI双染法流式细胞术检测精子质膜完整性的研究

目的:探讨应用荧光染料SYBR-14/碘化丙啶(SYBR-14/PI)双色标记法进行流式细胞术检测精子质膜完整性的可行性及其临床意义。方法:收集208例男性精液标本,按WHO精液分析标准分为正常组(n=31)与异常组(n=177)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本洗涤处理后经SYBR-14/PI双染后上流式细胞仪(FCM)分析,用发绿色荧光精子百分率(SYBR-14+/PI-%)表示质膜完整精子(PMI)的比例。结果:正常组与异常组SYBR-14+/PI-与SYBR-14-/PI+精子百分率均存在统计学差异(P均<0.05)。正常组精子SYBR-14+/PI-%为(55.66±20.64)%,显著高于异常组[(39.71±19.21)%,P=0.000]。208例标本中,SYBR-14+/PI-%与精子活动率呈显著正相关(r=0.408,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈显著正相关(r=0.398,P=0.000),与d级精子百分率呈显著负相关(r=-0.413,P=0.000);SYBR-14-/PI+%与精子活动率呈显著负相关(r=-0.380,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈显著负相关(r=-0.397,P=0.000),与d级精子百分率呈显著正相关(r=0.385,P=0.000);SYBR-14+/PI+%与精子活动率呈正相关(r=0.172,P=0.013),与(a+b)级精子百分率呈正相关(r=0.177,P=0.011),与d级精子百分率呈负相关(r=-0.164,P=0.018)。结论:应用流式细胞术SYBR-14/PI双染法检测精子质膜完整性具有可行性,可用于评估男性生育力。

罗丹明/碘化吡啶双染法检测精子线粒体膜功能的研究

目的:探讨罗丹明/碘化吡啶(Rh123/PI)双染法检测精子线粒体膜功能的可行性及临床意义。方法:收集63例精液标本,按WHO精液分析标准分成正常组(n=31)与异常组(n=32)。精子用Rh123/PI染色,流式细胞仪(FCM)分析。结果:正常组与异常组精子Rh123+PI-、Rh123-/PI+、Rh123-/PI-百分率均存在统计学差异(P均<0.05);Rh123+PI-与精子活动率呈正相关(r=0.549,P=0.000),与(a+b)级精子百分率呈正相关(r=0.531,P=0.000),与d级精子百分率呈负相关(r=-0.586,P=0.000);Rh123-/PI+与精子活率负相关(r=-0.586,P=0.000),与(a+b)级精子百分率负相关(r=-0.594,P=0.000),与d级百分率精子正相关(r=0.585,P=0.000),Rh123-/PI-仅与异常组的密度有相关性(r=-0.563,P=0.001)。结论:运用Rh123/PI双染法鉴定精子的线粒体膜功能具有可行性,可用于评估男性生育力。

溶脲脲原体感染对男性不育患者精子质膜完整性的影响

目的:应用荧光染料SYBR-14/碘化丙锭(PI)双标法流式细胞术检测溶脲脲原体(Uu)感染对男性不育患者精子质膜完整性的影响。方法:收集63例男性精液标本,分为Uu感染组(n=32)和正常对照组(n=31)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析,培养法进行Uu检测。精液标本经PBS洗涤处理后用荧光染料SYBR-14/PI双染后上流式细胞仪分析,用发绿色荧光精子百分率(SYBR-14+/PI-%)表示质膜完整精子的比例,检测精子质膜完整性。结果:Uu感染组精子质膜完整性[(45.14±10.69)%versus(72.68±9.91)%]和(a+b)级精子百分率[(23.29±8.81)%versus(46.32±9.54)%]均显著低于正常对照组(P<0.01),两组间精液量、pH值、精子浓度差异无显著性(P>0.05)。结论:Uu感染引起精子质膜完整性下降,可能是导致男性不育的重要原因之一。

剪碎法及匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液的方法比较

目的:比较剪碎法和匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液的效果。方法:实验于2006-10-25/2007-04-01在安徽医科大学第一附属医院中心实验室进行。切取兔肌肉VX2肿瘤组织块,分别采用剪碎法和匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液。经苏木精-伊红染色,光学显微镜观察细胞形态学差异,并行AnnexinV/PI双染法,流式细胞仪分析细胞凋亡率和细胞坏死率的差异。结果:①细胞形态:匀浆法细胞产率高,细胞形态完整,细胞分布均匀,细胞碎片及细胞团较少;而剪碎法所得细胞悬液在光镜视野中有较多的杂质和细胞团,完整的细胞相对较少。②流式细胞仪分析结果:匀浆法制备的单细胞悬液左下象限正常细胞分布较集中,右下象限凋亡细胞较少,左上象限坏死细胞及细胞碎片较少;所得细胞凋亡率和细胞坏死率值明显低于剪碎法[细胞凋亡率:(8.90±1.24)%,(15.75±1.53)%;细胞坏死率(35.22±1.56)%,(40.16±1.68)%,P均<0.01]。结论:用匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液优于剪碎法。

17β-雌二醇对高同型半胱氨酸诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的保护作用及机制

目的探讨17β-雌二醇(17β-E2)对高同型半胱氨酸(HHcy)诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的保护作用及其分子机制。方法体外培养的人成骨肉瘤MG63细胞经17β-E2干预后,再以不同浓度和(或)不同时间的HHcy处理后,采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸盐(H2DCFDA)探针检测细胞内活性氧(ROS)水平变化;通过Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)核双染法观察计数凋亡和坏死细胞;采用免疫印迹法检测促凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达变化。结果 1.17β-E2可明显抑制HHcy诱导的MG63细胞内ROS的增加,抑制效果随剂量和时间而增强;2.17β-E2可明显下调促凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达,对抗HHcy诱导的MG63细胞的凋亡和(或)坏死。结论 17β-E2可通过抑制ROS的产生,下调凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达而增强MG63细胞抗HHcy所诱导的氧化损伤作用。

高同型半胱氨酸诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的机制

目的探讨高同型半胱氨酸(HHcy)诱导人成骨肉瘤MG63细胞损伤的分子机制。方法体外培养的人成骨肉瘤MG63细胞经不同浓度(0.001mol/L、0.003mol/L和0.005mol/L)的Hcy处理不同时间后,采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸盐(H2 DCFDA)探针在荧光分光光度计下检测细胞内活性氧(ROS)变化水平;通过Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)核双染法在荧光显微镜下观察计数凋亡和坏死细胞;采用Western blotting法检测促凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达变化。结果在高浓度的Hcy刺激下,以剂量和时间依赖的方式上调MG63细胞内ROS含量(P<0.05);同时,凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达明显增加,从而诱导MG63细胞的死亡。结论高浓度Hcy可通过增加MG63细胞内ROS的含量,上调凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达,导致MG63细胞的氧化损伤。

人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡

目的探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制。方法体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据最佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组。采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化。结果不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调。结论人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用。

流式细胞术检测精索静脉曲张患者精子质膜完整性的研究

目的:应用荧光染料SYBR-14/PI双色标记法进行流式细胞术检测精索静脉曲张患者精子质膜的完整性并探讨其临床意义。方法:随机收集120例男性精液标本,其中90例左侧精索静脉曲张患者分为3组:VC1组(精索静脉曲张Ⅰ度,n=30)、VC2组(精索静脉曲张Ⅱ度,n=30)和VC3组(精索静脉曲张Ⅲ度,n=30),正常生育男性为正常对照组(n=30)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本经PBS洗涤处理后用荧光染料SYBR-14/碘化丙锭(PI)双染后上流式细胞仪分析,用发绿色荧光精子百分率(SYBR-14+/PI-%)表示质膜完整精子(PMI)的比例,检测精子质膜完整性,并预见精子的受精能力。结果:精索静脉曲张各组患者与正常对照组之间SYBR-14+/PI-%、SYBR-14-/PI+%均存在统计学差异(P<0.01)。精索静脉曲张患者(VC1、VC2、VC3)代表精子质膜完整性指标(SYBR-14+/PI-%)的百分率分别是:[(54.85±3.78)%]、[(45.37±4.12)%]、[(35.14±4.91)%],均显著低于正常对照组[(70.79±6.71)%],其活力顺序为VC3<VC2<VC1<对照组;120例精液标本的相关性分析表明:SYBR-14+/PI-%与精子活动率呈显著正相关(r=0.965,P<0.01),与(a+b)级精子百分率呈显著正相关(r=0.874,P<0.01),与d级精子百分率呈显著负相关(r=-0.965,P<0.01),而与pH、精液量和液化时间无显著性差异(P>0.05)。结论:应用流式细胞术SYBR-14/PI双染法能快速、准确地检测精子质膜完整性,精索静脉曲张引起精子质膜完整性下降,可能是导致男性不育的重要原因之一。

苯并(a)芘对神经细胞的毒性及细胞色素P4501A1的诱导表达

目的探讨苯并(a)芘[B(a)P]对神经细胞毒性、细胞凋亡与细胞色素P4501A1(CYP1A1)诱导表达的关系。方法选用新生1～3d的SD大鼠,分离大脑皮质,进行神经元培养,在细胞培养第5天左右,选取生长良好的同批次神经细胞,以苯并(a)芘分别对神经细胞染毒,使苯并(a)芘终浓度分别为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L。继续培养40h,应用cck8试剂盒检测神经细胞活力、Annexin V和PI双染法进行细胞凋亡的检测,应用RT-PCR法检测神经细胞CYP1A1mRNA的表达,免疫组织化学SABC法检测神经元CYP1A1蛋白的表达。结果随着苯并[a]芘浓度的增加,神经细胞活力降低,早期凋亡率逐渐增高,细胞活力中高剂量组与对照组比较差异均有统计学意义,早期凋亡率仅高剂量组与对照组比较差异有统计学意义,趋势检验表明,细胞活力降低、凋亡率增高具有剂量依赖性。而且随B(a)P剂量的增高,CYP1A1mRNA及蛋白表达增多,有剂量-反应关系,CYP1A1基因和蛋白表达与神经细胞凋亡率的相关分析表明,神经细胞凋亡率与CYP1A1mRNA表达呈正相关(r=0.831,P<0.01);与CYP1A1蛋白表达呈正相关(r=0.780,P<0.01)。结论苯并[a]芘可致神经细胞凋亡,神经细胞CYP1A1诱导表达是神经细胞损伤的关键因素。

化痰散结中药对甲状腺细胞增殖与凋亡影响的实验研究

目的:研究化痰散结中药甲肿消对甲状腺FRTL细胞增殖与凋亡的影响。方法:用水煮浸渍提取方法制备甲肿消提取液,甲状腺FRTL细胞株采用含6H的F12培养基培养。中药提取液作用培养细胞,以MTT法测定不同浓度甲肿消对FRTL细胞的增殖影响;采用Annexin V/PI双染法,应用流式细胞仪检测细胞凋亡;PI单染,流式DNA定量法检测细胞周期。结果:甲肿消作用24 h,细胞半数抑制浓度IC50=0.8 mg/ml(含生药浓度),最大抑制率浓度为4.0 mg/ml。甲肿消作用后G0/G1期细胞增多,S和G2/M期细胞减少,增值指数(PI)显著降低,细胞凋亡增加;同时发现甲肿消对细胞增殖与凋亡的影响与作用剂量、作用时间成正相关。结论:甲肿消通过阻滞细胞从G0/G1期向S期转换,从而抑制细胞增殖,同时可诱导FRTL细胞的凋亡,并与作用剂量和作用时间正相关。

HBV感染相关性肝癌患者血清环状RNA circ_0000591表达及其沉默对HepG2.2.15细胞凋亡的影响

目的探讨环状RNA circ_0000591(has circ 0000591)在乙型肝炎病毒(HBV)感染相关肝癌患者血清中的表达及其沉默对HepG2.2.15细胞凋亡的影响。方法收集2019年5月-2021年5月新疆医科大学附属肿瘤医院收治的83例HBV相关肝癌患者作为肝癌组;同期收集83例HBV相关肝硬化患者为肝硬化组。通过患者电子病历系统收集患者性别、年龄、体质量指数(BMI)和基础疾病。采用生化自动分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT);化学发光法测定血清甲胎蛋白(AFP);双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg);荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测血清HBV-DNA水平。采用Pearson相关分析血清has circ 0000591与ALT、HBsAg、HBV-DNA及AFP水平相关性。构建沉默has circ 0000591 HepG2.2.15细胞模型,设置siRNA组、NC组和control组。AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果肝癌组has circ 0000591、ALT、AFP水平高于肝硬化组,HbsAg、HBV-DNA水平低于肝硬化组(P<0.05);两组患者血清has circ 000059水平与血清HBsAg和HBV-DNA呈负相关(P<0.05);肝癌组患者血清has circ 000059水平与血清AFP呈正相关(P<0.05);两组患者血清has circ 000059水平与血清ALT无相关关系;siRNA组细胞凋亡率高于control组和NC组(P<0.05)。结论血清has circ 0000591在HBV感染相关性肝癌中高表达;沉默has_circ 0000591可诱导肝癌HepG2.2.15细胞凋亡,可能作为临床潜在评估肝脏损伤的生物标志物。

蒙药珍宝丸对新生大鼠缺氧性脑损伤脑组织的保护作用研究

目的:探讨蒙药珍宝丸对新生大鼠缺氧性脑损伤脑组织的保护作用。方法:取新生7天Wistar大鼠200只,雌雄不限,随机分成5组,每组40只;将新生Wistar大鼠置于8%O2+92%N2(V/V)的缺氧箱内建立新生鼠缺氧模型。在造模前每日一次连续7天灌胃给予生理盐水和珍宝丸,缺氧期间也同样剂量给药,分别于缺氧后12 h、24 h、48 h、72 h处死动物取血及脑组织。采用ELISA法检测大鼠血清及脑组织中IGF-1的蛋白含量;采用Annexin V/PI双染色法检测各组大鼠脑组织中神经元细胞凋亡率。结果:ELISA法检测结果显示,与正常对照组比较,大鼠血清及脑组织中IGF-1蛋白含量,在模型缺氧1h、4 h组均随时间的延续逐渐降低(P<0.01);珍宝丸缺氧1 h和4 h治疗组在12 h、24 h、48 h、72 h时间点IGF-1蛋白含量均略降低,12 h时间点差异有统计学意义(P<0.05),其他各时间点无统计学差异(P>0.05);1 h组在各时间点上明显高于4h组。Annexin V/PI双染色法检测结果显示,与正常对照组比较,模型缺氧1 h、4 h组均在24 h时间点细胞凋亡率最高,随时间的延续细胞凋亡率下降,至72 h时间点细胞凋亡率低于12 h(P<0.01);珍宝丸缺氧1 h和4 h治疗组12 h细胞凋亡率明显升高(P<0.01),24 h、48 h、72 h时间点细胞凋亡率略升高(P<0.01)。结论:珍宝丸可通过上调缺氧性脑损伤大鼠血清及脑组织中IGF-1蛋白含量,降低神经元细胞的凋亡率,从而对缺氧性脑损伤具有一定的保护作用。