重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值

目的 探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法 以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论 rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。

马立克病病毒的38kd磷蛋白基因重组产物对雏鸡的免疫抑制作用

在ＳＰＦ来源的一日龄雏鸡，不论是注射能表达马立克病病毒（ＭＤＶ）的３８ｋｄ磷蛋白（ｐｐ３８）基因的重组杆状病毒感染的昆虫Ｓｆ９细胞裂解物还是注射经亲和层析提纯的重组ＭＤＶｐｐ３８，都能抑制雏鸡的体液免疫反应，表现为相应雏鸡对注射小鼠红血球５～７ｄ后的血球凝集抗体的平均滴度比对照鸡低１．３８～１．６８个Ｌｏｇ２（ｐ＜０．０２５）和２．５５～３．２５个Ｌｏｇ２（ｐ＜０．００５）。

结核分支杆菌38KD蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建和克隆结核分枝杆菌38kD蛋白的基因,以转基因技术导入大肠杆菌,诱导表达,以获得大量38kD抗原。方法根据GenBank上编码38kD蛋白的基因系列,设计一对特异引物,通过PCR技术从结核分支杆菌H37Rv基因扩增出38kD蛋白基因片段;目的基因连接到克隆载体pMD18-TSimple Vector,测序鉴定,目的片段双酶切下来克隆到原核表达载体pET-30a中,成功构建成带有N末6His-tag的融合表达载体。表达载体用化学转化法转化E·coliBL21(DE3),用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/LIPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量最高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果。结果38kD序列与GenBank报道完全一致;用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/LIPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量最高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示,在大约38kD处有表达产物特异条带;可溶性分析表明,该重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;纯化的包涵体纯度达到90%。结论获得38kD蛋白工程菌株,为将此抗原用于临床诊断应用打下基础。

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素(heparin-binding hemagglutinin adhesin,HBHA)、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象,以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0.630,0.430,0.470;恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0.340,0.248,0.271,结核组高于恶性胸腔积液组,差异有统计学意义(P<0.001);ROC曲线分析结果显示,胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0.46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90.7%、特异度为90.0%、准确度为90.4%。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论 HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值,优于MPT64及38kD蛋白。

血清38KDIgG抗体和分枝杆菌IgG抗体检测对肺结核诊断价值的探讨

以重组３８ＫＤ蛋白，重组３８ＫＤ蛋白和结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒａ高度纯化的脂多糖（ＬＰＳ）为抗原，采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测了４５例菌阳肺结核，９４例菌阴肺结核，１３例肺炎，１例非结核分枝杆菌感染，２例麻风和３３例健康人血清中３８ＫＤＩｇＧ抗体和分枝杆菌ＩｇＧ抗体（３８ＫＤ和ＬＰＳＩｇＧ抗体），并与纯化蛋白衍生物（ＰＰＤ）抗原进行了比较。结果表明。

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素（heparin-bindinghemagglutininadhesin，HBHA）、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象，以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0．630，0．430，0．470，恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0．340，0．248，0．271，结核组高于恶性胸腔积液组，差异有统计学意义（P〈0．001）；ROC曲线分析结果显示，胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0．46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90．7％、特异度为90．0％、准确度为90．4％。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值，优于MPT64及38kD蛋白。

血清抗脂阿拉伯甘露糖及38kD抗体检测对涂阴肺结核及肺外结核诊断价值

目的 评估血清抗脂阿拉伯甘露糖及 38kDa抗体 (LAM 38kD IgG)检测对涂阴肺结核和肺外结核的诊断价值。方法 采用斑点免疫金渗滤法 (dotimmunogoldfiltrationassay ,DIGFA)检测5 7例涂阴肺结核 ,5 2例肺外结核 ,32例涂阳肺结核 ,2 9例肺癌患者及 33例正常人血清中LAM 38kD IgG。 结果 涂阴肺结核组LAM 38kD IgG阳性率为 73.7% ,其中痰结核菌涂 (- )培 (+ )组为84 .6 % ,涂 (- )培 (- )组为 70 .5 %。肺外结核组阳性率为 71.2 % ,涂 (+ )肺结核组阳性率 93.8% ,肺癌组假阳性率 31% ,健康组假阳性率 9.1%。结论 血清LAM 38kD

I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.

结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

目的:构建含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK293T细胞,高效表达分泌性38kD蛋白。方法:设计合成的结核分枝杆菌38kD基因被克隆到T载体,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切鉴定正确后,PEI转染法导入293T细胞,换不含血清的DMEM培养基培养3 d后收集细胞及上清,采用Western印迹检测38kD蛋白的表达。结果:酶切结果显示,获得正确的含38kD基因的重组表达载体;Western印迹结果显示表达载体导入293T细胞中后能在细胞及上清中检测到38kD蛋白表达。结论:构建了含重组结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.0-38kD,该载体可在哺乳动物细胞HEK293T中高效分泌性表达38kD蛋白,为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。

马立克病病毒疫苗株CVI988的38kd磷蛋白基因双氨基酸突变株

利用单克隆抗体H1 9及间接免疫荧光抗体反应 (IFA) ,从经马立克病病毒 (MDV)强毒株Md1 1的38kd磷蛋白 (pp38)基因克隆质粒DNA转染的MDV疫苗毒CVI988株感染的鸡胚成纤维细胞中 ,筛选到一个点突变株CVI/rpp38(AA)。DNA序列测定结果表明 ,该点突变株pp38基因ORF的第 32 0位和 32 6位碱基均已从亲本CVI988株的“G”突变为“A” ,导致第 1 0 7和 1 0 9位氨基酸分别从精氨酸和甘氨酸转变为谷氨酰胺和谷氨酸。这个双氨基酸点突变株在IFA和免疫沉淀反应中与pp38特异性单抗H1 9都呈现阳性反应 ,但与另一个 pp38特异性单抗T6 5都完全不反应 ,表现出与亲本病毒完全相反的结果。本研究发现了MDV的pp38上二个特异性不同的抗原表位 ,并以确凿的证据证明了第 1 0 7及 1 0

38kD-lgG和TSPOT-TB联合检测在结核病诊断中的应用

目的：探讨抗结核抗体（38kD-lgG）和结核感染T细胞斑点试验（TSPOT-TB）联合检测在结核病临床诊断中的价值。方法采用上述两种方法单项或联合检测疑结核患者114例，其中结核患者72例，非结核患者42例，对检测结果进行比较分析。结果 TSPOT-TB及38kD-IgG试验单项检测结核菌阳性（菌阳）结核患者的敏感性分别为90.63%和78.13%，二者差异有统计学意义（P〈0.05），联合检测敏感性为96.88%。TSPOT-TB及38kD-IgG试验单项检测结核菌阴性（菌阴）结核患者的敏感性分别为80.00%和77.50%，联合检测敏感性为95.00%，联合检测与两种单项检测比较，差异有统计学意义（P〈0.05）。对照组中，TSPOT-TB及38kD-IgG试验特异性分别为90.48%和78.57%，联合检测特异性为66.67%。TSPOT-TB试验对3种肺外结核的检测敏感性显著高于38kD-IgG试验（P〈0.05）。结论对于菌阳患者，TSPOT-TB试验敏感性较高。对于菌阴患者，联合检测敏感性较高。38kD-lgG和TSPOT-TB联合检测可提高结核病的诊断敏感性。

结核分枝杆菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在结核病血清学诊断中的应用价值

目的探讨结核分枝杆菌融合抗原38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c在结核病血清学中的诊断价值。方法以痰涂片、痰培养和标准试剂盒作为对照,应用化学发光法(chemiluminescence immunoassay,CLEIA)检测结核病组、非结核呼吸系病组、健康对照组血清标本中38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c的抗体水平,评价其在结核病血清学中的诊断价值。结果 1肺结核病组38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c的抗体水平(143621.0±23231.7,179731.1±16342.1)明显高于非结核呼吸疾病组(27417.5±2371.8,32066.2±3310.9)和健康对照组(35262.9±5764.2,22765.5±3695.7),(P<0.05)。238k D-Rv1419、16k D-Rv2041c检测抗结核抗体的敏感度(69.0%,72.0%)、高于痰培养(21.0%)、38 k D(20.0%)、16 k D试剂盒(26.0%),(P<0.05)。338k D-Rv1419、16k D-Rv2041c检测抗结核抗体的特异度(85.4%,83.8%)高于38k D(61.1%)、16k D试剂盒(50.0%),(P<0.05)。4联合应用38k DRv1419、16k D-Rv2041c融合抗原检测抗结核抗体的敏感度为89.0%,明显高于38k D-Rv1419(69.0%)、16k DRv2041c(72.0%),(P<0.05)。结论结核分枝杆菌融合抗原38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c在结核病的血清学诊断上均具有较高的敏感度和特异度,其联合应用,能够提高抗结核抗体检测的敏感度。

结核杆菌重组基因16kD-38kD融合蛋白诊断结核病的应用价值

目的:构建结核杆菌16kD-38kD重组融合基因,纯化16kD-38kD融合抗原,进一步评价其在结核病血清学诊断中的应用价值。方法:通过构建重组结核杆菌16kD-38kD融合基因工程菌株,经亲和层析纯化融合蛋白,以此蛋白为抗原,建立金标免疫层析法检测结核病人血清中的特异性抗体,同时与单一的16kD重组蛋白和18kD重组蛋白进行比较。结果:16kD、38kD、16kD-38kD三种重组抗原检测肺结核病人血清201份检出率分别56.2%(113/201)、57.7%(116/201)、73.6%(148/201),融合蛋白抗原阳性检出率明显高于单一重组蛋白抗原,对菌阳血清的检出率达到81.9%;检测健康体检血清179份阴性符合率分别为87.2%(156/179)、89.9%(161/179)、88.8%(159/179),三种蛋白无明显差异。结论:16kD-38kD融合蛋白具有较好的敏感性和特异性,与单一使用两种蛋白比较,对结核病人血清抗体的检出率有很大的提高,在结核病血清学诊断中有较高的参考价值。

马立克氏病病毒38kd磷蛋白H19-和T65-抗原表位分析及鸡对该抗原表位点突变病毒的免疫反应

对马立克氏病病毒(MDV)38 kd磷蛋白(pp38)基因的编码序列的测定表明,所有在间接荧光抗体试验(IFA)中与单抗H19反应的10个不同致病型MDV毒株,在第320位碱基为“A”,相应第107位氨基酸是谷氨酰胺,而在IFA中不与单抗H19反应的疫苗株CVI988相应位点分别是“G”和精氨酸。另一方面,在IFA中能与另一个单抗T65反应的毒株,在第326位碱基是“G”,第109位氨基酸是甘氨酸,而其他不与单抗T65反应的毒株,相应位点碱基和氨基酸分别是“A”和谷氨酸。通过比较CVI988及其在pp38基因的第320和326位的单一或双碱基点突变病毒CVI988/rpp38(AG)和CVI/rpp38(AA)对H19和T65的反应性,证明了在第107和109位的谷氨酰胺和甘氨酸分别对pp38上的H19和T65两个抗原表位起关键作用。比较CVI988及其点突变株CVI/rpp38(AG)在SPF鸡诱发的抗体反应表明,接种了点突变株CVI/rpp38(AG)鸡的抗体反应出现得比天然株抗体反应明显延缓且显著降低。进一步对MDV不同抗原成分的相应抗体水平比较表明,该功能区内可能存在着第3个特异性抗原表位,它决定于CVI988株pp38第107位的精氨酸,而且天然CVI988株及其点突变株诱发的抗MDV抗体水平间的显著差异可能正与这个抗原表位相关。

重组结核分枝杆菌38KD-Rv1419特异性抗原在结核病诊断中的价值

目的评价结核分枝杆菌38KD-Rv1419重组蛋白在结核病血清学诊断中的应用价值。方法以痰涂片、培养为对照,采用化学发光法检测,评价68例结核病病人、61例非结核病病人血清中抗38KD-Rv1419抗体水平;绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线),确定其诊断结核病的临界值,并评价其诊断效能。结果结核病组抗38KD-Rv1419抗体表达水平为229791.9±63846.9,明显高于非结核呼吸病组的22987.5±5024.3(P<0.05)。38KD-Rv1419抗体检测的灵敏度(63.2%)明显高于痰涂片和培养(16.2%)(P<0.05)。结论结核分枝杆菌38KD-Rv1419重组蛋白具有较高的结核病血清学诊断价值。

38kD抗原特异TCR基因修饰T细胞的抗结核抗原活性研究

抗原特异T细胞受体(Tcell receptor,TCR)基因修饰T细胞已被应用于肿瘤、病毒感染过继免疫治疗研究,取得了鼓舞人心的结果,但在结核上未见报道.本研究利用结核分枝杆菌38kD抗原刺激人CD4+,CD8+T细胞,通过分析刺激前后T细胞TCR互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)谱型,从CD4+,CD8+T细胞中分别筛选出38kD抗原特异的TCR Vα11,Vβ8和Vα3,Vβ8基因家族T细胞,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得其α,β链全长基因并插入逆转录病毒载体,构建重组载体pMX-β8-IRES-α11-GFP(pβ8α11)和pMX-β8-IRES-α3-GFP(pβ8α3),分别转染初始CD4+,CD8+T细胞,检测其体外抗结核抗原活性.结果显示,TCR基因修饰的CD4+,CD8+T细胞均表达外源性TCR,不仅能特异性识别抗原,且介导免疫效应功能,表明结核抗原特异TCR基因修饰的T细胞具有应用于多药耐药结核患者过继细胞免疫治疗的可能.

结核分枝杆菌重组38kD蛋白用于新疆南疆维吾尔族和湖南湘中汉族血清学诊断的研究

目的:对结核分枝杆菌38kD蛋白编码基因进行克隆表达及纯化,建立基于重组38 kD蛋白的酶联免疫吸附法(ELISA)检测结核病人血清标本,评价重组38 kD蛋白用于结核病血清学诊断抗原的价值。并比较分析其在汉族和维吾尔族人群中的血清学诊断的差异。方法:用PCR方法扩增38 kD蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,得到纯化的38 kD蛋白,建立以38 kD蛋白为包被抗原的ELISA,并检测临床确诊的结核病人血清标本。结果:ELISA检测结核病患者血清标本的维吾尔族阳性率为34%(52/153),汉族为52.4%(65/124),两者对比有统计学差异(X2=9.538,P<0.005)。在阴性对照中的维吾尔族特异度为96.4%(159/165),汉族为98.8%(130/133),结果无统计学意义(X2=0.111,P>0.5)。结论:重组38kD蛋白用于血清学诊断的敏感度在维吾尔族和汉族中有差异,而其诊断特异度无差别。

结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测

目的:克隆38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性。方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性。结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性。结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。

检测血清中抗结核抗体辅助诊断儿童结核病

目的 探讨检测血清抗结核脂阿拉伯甘露糖 B和 38kd抗体 IgG (LAM B+38kd IgG)对儿童结核病的诊断价值。方法 检测采自235例患儿的标本(包括血清、脑脊液、胸水、腹水、胃液)中抗结核抗体。结果 血清抗体阳性率:(1)肺内、外结核组两组间无显著性差异(P>0.05),分别为32.14%(18/56) 和20.41%(10/49);(2)菌检阳性组明显高于菌检阴性组抗体阳性率分别为64.00%(16/25)和34.29%(12/35),组间有显著性差异(P<0.05)。结论 血清抗LAM B+38kd IgG检测对结核病儿童有辅助诊断价值。

表达强毒pp38决定簇的马立克病病毒疫苗毒CVI988点突变株的构建和特性

用鸡马立克病病毒（ＭＤＶ）强毒ＧＡ株的３８ｋＤ磷蛋白（ｐｐ３８）基因克隆ＤＮＡ转染Ⅰ型弱毒疫苗ＣＡＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ株ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞，再用能识别Ⅰ型强毒ｐｐ３８的单克隆抗体Ｈ１９做免疫荧光试验，筛选到能在ｐｐ３８基因上表达强毒株特异性抗原决定簇的定向点突变弱毒株ＣＶＩ／ｒｐｐ３８。用３５Ｓ－蛋氨酸标记的细胞裂解物做免疫沉淀反应表明，单抗Ｈ１９不能识别天然ＣＶＩ９８８株ＭＤＶ中的ｐｐ３８，但却能从感染了重组病毒ＣＶＩ／ｒｐｐ３８的细胞识别出ＭＤＶｐｐ３８蛋白带，如同从ＭＤＶ的其它强毒株识别出ｐｐ３８一样。接种了ＣＶＩ／ｒｐｐ３８病毒的鸡，其ＭＤＶ特异性抗体滴度显著低于接种了原疫苗毒ＣＶＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ克隆株的鸡，这进一步证明了强毒ＭＤＶ的ｐｐ３８具有免疫抑制作用。