日本血吸虫可溶性虫卵抗原38kDa分子Dipstick快速诊断模式的初步建立

目的 建立简便的血吸虫病Ｄｉｐｓｔｉｃｋ快速诊断比方法 以纯化的日本血吸虫虫卵可溶性抗原（ＳＥＡ）３８ｋＤａ分子为诊断抗原，以胶体金标记的鼠抗人ＩｇＧ为二抗，建立 Ｄｉｐｓｔｉｃｋ快速诊断体系；检测日本血吸虫病人血清，急性期３７例、慢性期３０例，正常人５２例，肝吸虫病人血清３０例。结果 所测得的阳性率分别为９４．６％、８６．７％、１．９％、０％．伯论 以 ＥＡ ３８ｋＤａ纯化分子建立的血吸虫病Ｄｉｐｓｔｉｃｋ快速诊断法具有较好的敏感性和特异性，且简便快捷。

猪链球菌2型溶血素基因与38KDa蛋白基因克隆及联合表达

目的:研究有效的猪链球菌病疫苗。方法:以四川株猪链球菌2型基因组DNA为模板分别扩增溶血素基因和38KDa基因主要功能区基因;并经连接、克隆及酶切鉴定。分别构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,提取阳性克隆质粒分别进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与SS2阳性血清发生特异性反应。结论:本研究为重组蛋白的免疫保护应用奠定基础。

日本血吸虫成虫38kDa天然分子抗原的分离纯化与免疫保护性的研究

目的研究日本血吸虫成虫可溶性抗原38kDa(SjAWA38kDa)的动物保护作用,并对SjAWA38kDa作为抗日本血吸虫病分子疫苗的可行性进行评估。方法用SDS-PAGE电泳、切胶、电洗脱、超滤等方法分离纯化SjAWA38kDa,继而用SjAWA38kDa免疫昆明小鼠,然后进行尾蚴攻击感染(40尾/只),进行减虫率和减卵率研究。结果SjAWA 38kDa天然蛋白质分子能刺激机体产生抗日本血吸虫的作用,其减虫率为33.8%,减卵率为51.7%,有统计学意义(P<0.05)。结论SjAWA 38kDa分子抗原具有刺激机体产生抗日本血吸虫病的免疫保护作用,可以作为抗日本血吸虫病分子疫苗研究的靶标。

重组结核分枝杆菌38KDa蛋白抗原制备及其血清学诊断价值

目的通过基因工程技术获取纯化的结核分枝杆菌重组38KDa蛋白并评价其血清学诊断价值。方法在大肠杆菌中表达38KDa蛋白,通过亲和层析纯化并复性后用于ELISA检测结核患者血清中特异性抗结核抗体。结果38KDa蛋白表达量占总蛋白的22.80%,以包涵体的形式存在。纯化复性后的蛋白抗原检测54例肺结核患者敏感性为62.96%,其中检测痰涂阳性和痰涂阴性患者的敏感性分别为64.29%和62.50%,二者无显著性差异(χ2=0.02,P>0.05),检测38KDa抗体特异性为84.38%。另外,通过与结核蛋白芯片检测,结果比较发现研制的重组38KDa蛋白免疫活性与国外进口的蛋白免疫活性相当。结论制备的重组38KDa蛋白抗原具有血清学诊断价值,可用于结核病诊断试剂的开发。

重组结核分枝杆菌38KDa蛋白用于军人结核分枝杆菌感染筛查

目的评价重组结核分枝杆菌蛋白38KDa皮试注射液（rTPA38）用于军人结核分枝杆菌感染筛查的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）为对照，采用同体双臂Mantoux法（皮内注射）为1150人同时做PPD和rTPA38皮试；皮试后24h，48h双盲测量皮试反应（包括红晕或硬结）。PPD和rTPA38皮试阴性者接种卡介苗，3个月后同前进行皮试试验。结果局部皮肤红晕（或硬结）横、纵平均直径≥5mm为阳性。24．6％受试者rTPA38皮试反应阳性，阳性反应直径集中于5mm～10mm；53．0％受试者PPD皮试反应阳性，阳性反应直径集中于5mm～15mm。rTPA38皮试反应阳性率随年龄增长基本呈现上升趋势，同一年龄段，rTPA38皮试反应阳性率明显低于PPD（P〈0．01）。有卡痕与无卡痕受试者rTPA38皮试反应阳性率比较、统计学分析差异有极显著性意义（χ^2=27．06，P〈0．01）。PPD皮试阳转率与rT—PA38皮试阳转率分别为62．0％和27．2％，两者比较差异有极显著性意义（χ^2=52．90，P〈0．01）。结论rTPA38可作为结核分枝杆菌感染筛查的诊断试剂。

重组38kDa抗原对结核病诊断应用价值的评价

目的初步评价重组38kDa在检测血清中抗结核抗体方面的应用价值。方法用不同浓度的重组蛋白38kDa包被ELISA板,分别用结核病阳性血清和阴性对照及空白对照血清,确定ELISA板最佳包被浓度。再根据已确定的浓度包被ELISA板,检测205份血清(包括105份患者血清和100份阴性对照血清)。结果经检测最佳蛋白包被浓度为2μg/mL,最佳血清稀释度为1∶225。结核38kDa抗原ELISA检测的总灵敏度为55.2%,阳性预测值为93.5%。结论重组38kDa诊断的阳性预测能力比较高,有助于临床医师的诊断。

实时定量PCR检测耐异烟肼结核分枝杆菌Ag85B、38kDa及MPT64 mRNA表达水平

目的运用实时定量PCR(Real-time PCR)检测结核分枝杆菌耐异烟肼菌株和敏感株Ag85B、38kDa及MPT64编码基因(fbpB、psts1、mpt64)的mRNA表达水平,探讨结核分枝杆菌耐异烟肼株和敏感株的蛋白抗原在转录水平的差异性。方法根据GenBank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1、mpt64及内参基因Sigа的特异引物,将fbpB、psts1、mpt64及Sigа扩增片段克隆入载体pMD18-T simple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用SYBR GreenⅠ荧光染料建立检测fbpB、psts1、mpt64的实时定量PCR方法,并应用此方法检测22株耐异烟肼菌株及25株敏感菌株(含H37Rv标准株)中fbpB、psts1、mpt64的mRNA表达水平。结果耐异烟肼菌株的fbpB表达水平为0.65±0.22,敏感菌株的表达水平为0.36±0.13,两者有显著性差异(t=5.683,P<0.01)。耐异烟肼菌株的psts表达水平为13.63±4.16,敏感菌株的表达水平为9.86±2.79,两者差异有统计学意义(t=3.869,P<0.01)。耐异烟肼菌株的mpt64表达水平为5.89±3.22,敏感菌株的表达水平为7.67±4.52,差异无统计学意义(t=1.552,P>0.05)。结论成功建立了fbpB、psts1、mpt64基因的实时定量检测方法,检测显示耐异烟肼菌株的fbpB、psts1基因的mRNA表达水平显著高于敏感菌株,可能为耐异烟肼MTB的实验室诊断提供分子标识。

重组结核分枝杆菌38kDa蛋白的表达、纯化和复性及免疫特性的研究

目的构建结核分枝杆菌38kDa的重组质粒,在大肠杆菌中表达、纯化和复性重组蛋白,并评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出psts1基因片段,连接到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签(His-Tag)纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构。结果构建了含38kDa重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白38kDa,其占细胞总蛋白的55%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构,经蛋白印迹证实重组蛋白能与结核杆菌多克隆抗体结合。结论具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原。

重组结核分枝杆菌38KDa蛋白的免疫学特性研究

目的:探讨利用毕赤酵母表达体系表达的重组结核分枝杆菌38KDa蛋白的免疫学特性。方法:利用甲醇作为诱导剂诱导表达重组结核分枝杆菌38KDa蛋白,之后以高、低剂量免疫BALB/c小鼠,同时设BCG疫苗对照组和PBS空白对照组,每2周免疫1次,第3次免疫2周后剪尾取血,分离血清,ELISA法检测免疫小鼠血清中的抗体和IFN-γ表达水平。9周后,处死小鼠并分离各组小鼠的脾淋巴细胞,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖。结果:重组结核分枝杆菌38KDa蛋白免疫小鼠后,能产生较高滴度抗体;38KDa蛋白高、低剂量诱导组脾淋巴细胞增值刺激指数(SI)均高于PBS对照组(P<0.05),与BCG组无差异(P>0.05);高、低剂量组IFN-γ的表达水平明显高于PBS对照组(P<0.05),与BCG组无差异(P>0.05),高低剂量组间SI、IFN-γ水平均无差异(P>0.05)。结论:重组38KDa蛋白在动物机体内表现有一定的免疫原性,可以作为结核病新疫苗的备选抗原之一。

38kDa抗原用于肺结核血清学诊断的meta分析

目的系统评价38kDa抗原对肺结核的诊断价值并作meta分析。方法制定原始文献的纳入、排除标准及检索策略，检索Pubmed，EMBASE，BIOSIS，WebofScience以及维普、万方、中国知网（日期：1990年1月01日-2009年11月30日。纳入的文献采用QUADAS进行质量评价，用MetaDisc1．4软件进行meta分析。结果符合标准的共有26个研究，备研究间存在畀质性，但不存在阈值效应。合并后的诊断优势比为29．48195％C1（14．43～60．26）1，敏感度为O．53195％CI（0．51-0．55）]，特异度为O．94195％CI（0．93～0．95）]，阳性似然比为14．22195％CI（6．77—29．89）】，阴性似然比为0．51195％CI（0．45～0．57）]。SROC曲线的AUC面积为0．730，Q＊指数为0．667。结论血清38kDa诊断肺结核的效能中等，不能取代痰涂片检查。

qRT-PCR检测结核分枝杆菌蛋白抗原编码基因表达水平

目的运用实时定量PCR(quantitative real-time,qRT-PCR)检测结核分枝杆菌蛋白Ag85B、38kDa及MPT64编码基因的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株和敏感株,北京基因型和非北京基因型的蛋白抗原在转录水平的差异性及qRT-PCR诊断活菌的价值。方法根据Genbank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1、mpt64及内参基因Sigа的特异性引物,将扩增片段克隆入载体pMD18-T simple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用SYBR GreenⅠ荧光染料建立检测fbpB、psts1、mpt64基因表达水平的实时定量PCR方法。选用46株结核分枝杆菌临床分离株,以及2株非结核分枝杆菌。应用qRT-PCR检测上述菌株、H37Rv国际标准株fbpB、psts1、mpt64基因的表达水平。结果结核分枝杆菌活菌的扩增结果呈典型的S型曲线,而结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,没有检测到荧光信号;耐药组中的mpt64基因表达水平低于敏感组及H37Rv标准株,有统计学意义(t=3.093,P<0.01;t=2.545,P<0.05),北京基因型组中的psts1基因表达水平低于非北京基因型组及H37Rv标准株。结论有统计学意义(t=2.567,P<0.05;t=2.373,P<0.05)。结论成功建立了fbpB、psts1、mpt64基因的qRT-PCR检测方法,该方法可以快速判断活菌与死菌。检测发现耐药组中的mpt64基因表达水平低于敏感组及H37Rv标准株;北京基因型组中的psts1基因表达水平低于非北京基因型组及H37Rv标准株。

广州地区部分就诊病人结核菌抗体检测结果趋势分析

近年来结核病在我国以及全世界有明显回升的趋势[1]。1993年世界卫生组织（WHO）将结核病列为重点控制的传染病之一,1998年WHO再次提出遏制结核病的传播与感染。据WHO2008年全球结核病控制报告,我国结核病发病人数居全球第二位。

OT强阳性新兵血清抗38KD_a抗体检测的意义

目的:调查新兵亚临床结核感染与OT试验强阳性的相关性,探讨军队结核病预防新措施。方法:采用ELISA和免疫层析法分别检测了10399名新兵中OT强阳性者血清抗38KDa抗体和抗LAM(脂阿拉伯甘露聚糖)抗体;对抗体阳性者作为期3个月随访和1年信访。结果:OT强阳性新兵血清抗LAM抗体均为阴性;无卡痕和有卡痕OT强阳性组血清抗38KDa抗体阳性分别有5例和1例,阳性比率分别为3.96%和0.56%,差异显著(P<0.05)。抗体阳性者3个月随访发现:无卡痕OT强阳性组有3例新兵出现结核体质特征或症状,其中2例1年内诊断为胸膜炎结核,1例因身体不适调离原工作岗位。结论:血清抗38KDa抗体水平与新兵结核菌亚临床感染有关。OT强阳性且38KDa抗体阳性新兵,应给于3个月预防性抗痨治疗。

结核快速诊断免疫色谱卡对活动性肺结核病情评价作用

目的 评价从结核分支杆菌中提取38kDa抗原制备结核快速诊断免疫色谱卡系统（ICT卡）对活动性肺结核血清学评判意义。方法 采用ICT卡检测261例结核病患者血清中38kDa相应4种不同抗体。结果 肺结核阳性率69．79％，明显高于肺外结核56．25％，P＜0．05。肺结核进展、吸收好转、稳定期阳性率分别为79．76％、50．79％、16．67％，P＜0．05。肺结核病灶＞1／2肺野伴有空洞和＜1／2不伴有空洞者阳性率为84．48％、63．20％，P＜0．05；痰结核分支杆菌、DNA、血清PPD－IgG阳性者ICT卡阳性率明显高于三项阴性者，P＜0．05。结论 本方法不仅对结核病具有较高诊断价值，对评判活动性肺结核病情、考核疗效、估计预后也有较好意义，且方法安全、简便、快速，不需昂贵仪器，值得推广应用。