结核分支杆菌38KD蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建和克隆结核分枝杆菌38kD蛋白的基因,以转基因技术导入大肠杆菌,诱导表达,以获得大量38kD抗原。方法根据GenBank上编码38kD蛋白的基因系列,设计一对特异引物,通过PCR技术从结核分支杆菌H37Rv基因扩增出38kD蛋白基因片段;目的基因连接到克隆载体pMD18-TSimple Vector,测序鉴定,目的片段双酶切下来克隆到原核表达载体pET-30a中,成功构建成带有N末6His-tag的融合表达载体。表达载体用化学转化法转化E·coliBL21(DE3),用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/LIPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量最高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果。结果38kD序列与GenBank报道完全一致;用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/LIPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量最高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示,在大约38kD处有表达产物特异条带;可溶性分析表明,该重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;纯化的包涵体纯度达到90%。结论获得38kD蛋白工程菌株,为将此抗原用于临床诊断应用打下基础。

结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

目的:构建含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK293T细胞,高效表达分泌性38kD蛋白。方法:设计合成的结核分枝杆菌38kD基因被克隆到T载体,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切鉴定正确后,PEI转染法导入293T细胞,换不含血清的DMEM培养基培养3 d后收集细胞及上清,采用Western印迹检测38kD蛋白的表达。结果:酶切结果显示,获得正确的含38kD基因的重组表达载体;Western印迹结果显示表达载体导入293T细胞中后能在细胞及上清中检测到38kD蛋白表达。结论:构建了含重组结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.0-38kD,该载体可在哺乳动物细胞HEK293T中高效分泌性表达38kD蛋白,为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。

重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值

目的 探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法 以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论 rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。

马立克病病毒的38kd磷蛋白基因重组产物对雏鸡的免疫抑制作用

在ＳＰＦ来源的一日龄雏鸡，不论是注射能表达马立克病病毒（ＭＤＶ）的３８ｋｄ磷蛋白（ｐｐ３８）基因的重组杆状病毒感染的昆虫Ｓｆ９细胞裂解物还是注射经亲和层析提纯的重组ＭＤＶｐｐ３８，都能抑制雏鸡的体液免疫反应，表现为相应雏鸡对注射小鼠红血球５～７ｄ后的血球凝集抗体的平均滴度比对照鸡低１．３８～１．６８个Ｌｏｇ２（ｐ＜０．０２５）和２．５５～３．２５个Ｌｏｇ２（ｐ＜０．００５）。

结核分枝杆菌重组38kD蛋白用于新疆南疆维吾尔族和湖南湘中汉族血清学诊断的研究

目的:对结核分枝杆菌38kD蛋白编码基因进行克隆表达及纯化,建立基于重组38 kD蛋白的酶联免疫吸附法(ELISA)检测结核病人血清标本,评价重组38 kD蛋白用于结核病血清学诊断抗原的价值。并比较分析其在汉族和维吾尔族人群中的血清学诊断的差异。方法:用PCR方法扩增38 kD蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,得到纯化的38 kD蛋白,建立以38 kD蛋白为包被抗原的ELISA,并检测临床确诊的结核病人血清标本。结果:ELISA检测结核病患者血清标本的维吾尔族阳性率为34%(52/153),汉族为52.4%(65/124),两者对比有统计学差异(X2=9.538,P<0.005)。在阴性对照中的维吾尔族特异度为96.4%(159/165),汉族为98.8%(130/133),结果无统计学意义(X2=0.111,P>0.5)。结论:重组38kD蛋白用于血清学诊断的敏感度在维吾尔族和汉族中有差异,而其诊断特异度无差别。

血清38KDIgG抗体和分枝杆菌IgG抗体检测对肺结核诊断价值的探讨

以重组３８ＫＤ蛋白，重组３８ＫＤ蛋白和结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒａ高度纯化的脂多糖（ＬＰＳ）为抗原，采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测了４５例菌阳肺结核，９４例菌阴肺结核，１３例肺炎，１例非结核分枝杆菌感染，２例麻风和３３例健康人血清中３８ＫＤＩｇＧ抗体和分枝杆菌ＩｇＧ抗体（３８ＫＤ和ＬＰＳＩｇＧ抗体），并与纯化蛋白衍生物（ＰＰＤ）抗原进行了比较。结果表明。

表达强毒pp38决定簇的马立克病病毒疫苗毒CVI988点突变株的构建和特性

用鸡马立克病病毒（ＭＤＶ）强毒ＧＡ株的３８ｋＤ磷蛋白（ｐｐ３８）基因克隆ＤＮＡ转染Ⅰ型弱毒疫苗ＣＡＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ株ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞，再用能识别Ⅰ型强毒ｐｐ３８的单克隆抗体Ｈ１９做免疫荧光试验，筛选到能在ｐｐ３８基因上表达强毒株特异性抗原决定簇的定向点突变弱毒株ＣＶＩ／ｒｐｐ３８。用３５Ｓ－蛋氨酸标记的细胞裂解物做免疫沉淀反应表明，单抗Ｈ１９不能识别天然ＣＶＩ９８８株ＭＤＶ中的ｐｐ３８，但却能从感染了重组病毒ＣＶＩ／ｒｐｐ３８的细胞识别出ＭＤＶｐｐ３８蛋白带，如同从ＭＤＶ的其它强毒株识别出ｐｐ３８一样。接种了ＣＶＩ／ｒｐｐ３８病毒的鸡，其ＭＤＶ特异性抗体滴度显著低于接种了原疫苗毒ＣＶＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ克隆株的鸡，这进一步证明了强毒ＭＤＶ的ｐｐ３８具有免疫抑制作用。

结核杆菌重组基因16kD-38kD融合蛋白诊断结核病的应用价值

目的:构建结核杆菌16kD-38kD重组融合基因,纯化16kD-38kD融合抗原,进一步评价其在结核病血清学诊断中的应用价值。方法:通过构建重组结核杆菌16kD-38kD融合基因工程菌株,经亲和层析纯化融合蛋白,以此蛋白为抗原,建立金标免疫层析法检测结核病人血清中的特异性抗体,同时与单一的16kD重组蛋白和18kD重组蛋白进行比较。结果:16kD、38kD、16kD-38kD三种重组抗原检测肺结核病人血清201份检出率分别56.2%(113/201)、57.7%(116/201)、73.6%(148/201),融合蛋白抗原阳性检出率明显高于单一重组蛋白抗原,对菌阳血清的检出率达到81.9%;检测健康体检血清179份阴性符合率分别为87.2%(156/179)、89.9%(161/179)、88.8%(159/179),三种蛋白无明显差异。结论:16kD-38kD融合蛋白具有较好的敏感性和特异性,与单一使用两种蛋白比较,对结核病人血清抗体的检出率有很大的提高,在结核病血清学诊断中有较高的参考价值。

马立克氏病病毒38kd磷蛋白H19-和T65-抗原表位分析及鸡对该抗原表位点突变病毒的免疫反应

对马立克氏病病毒(MDV)38 kd磷蛋白(pp38)基因的编码序列的测定表明,所有在间接荧光抗体试验(IFA)中与单抗H19反应的10个不同致病型MDV毒株,在第320位碱基为“A”,相应第107位氨基酸是谷氨酰胺,而在IFA中不与单抗H19反应的疫苗株CVI988相应位点分别是“G”和精氨酸。另一方面,在IFA中能与另一个单抗T65反应的毒株,在第326位碱基是“G”,第109位氨基酸是甘氨酸,而其他不与单抗T65反应的毒株,相应位点碱基和氨基酸分别是“A”和谷氨酸。通过比较CVI988及其在pp38基因的第320和326位的单一或双碱基点突变病毒CVI988/rpp38(AG)和CVI/rpp38(AA)对H19和T65的反应性,证明了在第107和109位的谷氨酰胺和甘氨酸分别对pp38上的H19和T65两个抗原表位起关键作用。比较CVI988及其点突变株CVI/rpp38(AG)在SPF鸡诱发的抗体反应表明,接种了点突变株CVI/rpp38(AG)鸡的抗体反应出现得比天然株抗体反应明显延缓且显著降低。进一步对MDV不同抗原成分的相应抗体水平比较表明,该功能区内可能存在着第3个特异性抗原表位,它决定于CVI988株pp38第107位的精氨酸,而且天然CVI988株及其点突变株诱发的抗MDV抗体水平间的显著差异可能正与这个抗原表位相关。