大肠埃希氏菌表达FMDV3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌 ,高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV 3AB非结构蛋白进行纯化 ,经SDS PAGE分析 ,3AB融合蛋白纯度达 90 %以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性 ,通过Westernblotting分析 ,表明复性后的 3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明 ,复性后的 3AB融合蛋白有很好的抗原活性。

检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析

为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞。这6株MAbs亚类鉴定均为IgG1型,轻链均为κ链。间接免疫荧光试验结果表明,这6株MAbs均能够识别FMDV 3AB蛋白。采用制备的MAb对分段表达的3AB蛋白进行western blot分析,结合位点分别位于3AB的第aa 55～aa 70、aa 64～aa 79、aa 130～aa 145区段。该结果为进一步探索3AB蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定

利用PCR方法扩增获得EMCV非结构蛋白3AB基因,并将其克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM中,提取阳性克隆质粒转化至DH10Bac感受态细菌,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacm id-3AB,经脂质体介导转染sf9细胞获得重组杆状病毒,并IFA和W estern b lotting鉴定其抗原性。结果表明,EMCV 3AB基因在昆虫细胞中获得成功表达,分子量约16 ku,具有良好的EMCV抗原性。因此利用杆状病毒表达系统成功表达了EMCV 3AB基因,为该病毒抗原表位和诊断方法研究奠定了重要基础。

口蹄疫病毒3AB试剂盒的检测及比较

以重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB为检测抗原,研制了口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA检测试剂盒,该试剂盒可用于判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A/G作为第二抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法。结果表明,在1 746份免疫猪血清中,3AB-ELISA对免疫猪血清的特异性为98.68%;在1 077份健康非免疫猪血清中,3AB-ELISA对健康非免疫猪血清的特异性为98.68%;在36份人工感染猪血清中,3AB-ELISA对阳性检出率为100%。而牛的特异性的各项指标和阳性检出率分别为94.04%,97.96%和100%。猪/牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒与国外同类试剂盒比较,阳性检出率高出12.5个百分点。

口蹄疫病毒3AB克隆表达及其抗体间接ELISA检测方法建立与应用研究

采用重叠PCR方法人工合成3AB基因片段,将其克隆到PET-28a+载体,转化导入宿主菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小约为33Ku的重组表达蛋白。以纯化的重组表达蛋白为抗原,建立了检测猪FMDV 3AB NSP抗体的间接ELISA方法。将本方法与进口口蹄疫非结构蛋白3ABC阻断ELISA试剂盒进行比较,结果显示,本方法可以用于区分猪口蹄疫自然感染动物与疫苗免疫动物。

检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。