肠道病毒71型3C蛋白酶原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达肠道病毒71型3C蛋白酶(enterovirus 713C protease,EV71-3Cpro)并制备其特异性多克隆抗体。方法首先依据密码子优化原则合成EV71-3Cpro基因,将其克隆到pET-28a表达载体NdeⅠ和XhoⅠ位点间构建重组质粒,再以冷CaCl 2法将其转化到大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,优化原核表达条件。以HisTrap TM亲和层析柱进行分离纯化,以纯化的EV71-3Cpro作为抗原免疫大鼠,分离血清后以酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质印迹法(western blotting,WB)鉴定多克隆抗体的效价及其特异性。结果ELISA和WB结果显示制备的大鼠抗EV71-3Cpro多克隆抗体效价达1∶1024000,且具有较好的特异性。结论抗EV71-3Cpro多克隆抗体的成功制备为EV71-3Cpro生物学功能的研究及其联合疫苗的开发奠定了实验基础。

人鼻病毒3C蛋白酶发酵工艺研究

作为一种通过切割方式去除融合蛋白标签的工具酶,人鼻病毒3C蛋白酶除应用于学术研究外,也广泛应用于工业化,如在mRNA的体外转录合成中,需要用到3C蛋白酶去除若干合成酶因为各种目的所携带的标签。随着当前mRNA相关管线的扩增,对该酶的需求也将逐渐增加,从产业化角度考虑,极有必要对重组大肠杆菌发酵产3C蛋白酶进行工艺研究,为其放大至生产提供依据,具体的研究方法及结果如下:借助响应面分析方法优化了表达3C蛋白酶的大肠杆菌发酵培养基,确定培养基中对菌体生产具有显著影响的因素及最优浓度,即酵母粉4.94 g·L^(-1),蛋白胨8.60 g·L^(-1),甘油9.54 g·L^(-1),随后进行7 L发酵罐的放大发酵研究,确定pH值6.90~7.10,DO值15%~30%,培养温度37℃,诱导温度22℃的发酵条件,并考察了甜菜碱、山梨醇对菌体表达3C蛋白酶的影响。

口蹄疫病毒株OA/583C蛋白酶的结构模拟和功能分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-TEasy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定。该毒株与Poliovirus,Hepatitis Avirus和Human rhi-novirus 89毒株3C序列对比分析发现核苷酸序列一致性分别为38.8%,37.1%和36.5%,氨基酸序列一致性分别为23.7%,19.2%和17.6%。通过Swiss-pdbViewer软件模拟出FMDVOA/58 3C蛋白酶的3D结构和表面模型。并鉴定出此毒株3C蛋白酶的活性中心为Cys31-His46-Asp84。

口蹄疫病毒3C蛋白酶的T4噬菌体表面展示

对FMDV 3C基因克隆质粒p3C-T进行PCR扩增,获得了口蹄疫病毒3C蛋白酶基因片段,将此片段与T4噬菌体整合质粒pR的EcoRⅠ酶切片段连接,转化E．coli,DH5α工程菌,经EcoRⅠ酶切、质粒PCR扩增、插入方向筛选及测序鉴定,成功获得了T4噬菌体重组整合质粒pR- 3C。将其转化E．coli E2后,与SOC基因缺失的噬菌体φT4-Z1同源重组,经溶菌酶依赖性筛选,获得了快速溶菌型噬菌体φT4-3C。经噬菌体PCR扩增、SDS-PAGE分析和Western-bot分析,重组噬菌体可展示约26 ku的重组蛋白;其大小与预期相符,具有免疫原性。

口蹄疫病毒3C蛋白酶的结构及功能研究进展

口蹄疫病毒能引起牛、羊等偶蹄动物发生高度接触性的传染病口蹄疫,该病常常影响着全球畜牧业的发展。FMDV是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员,口蹄疫病毒为单股正链RNA病毒,病毒基因组全长约8.5 kb,基因组分为5′非编码区、3′非编码区和一个开放阅读框(ORF)。基因组的中部是一大的开放阅读框,编码一多聚蛋白,多聚蛋白在翻译的同时,经二级裂解后,形成3种病毒结构蛋白(VP0,VP3和VP1)和8种非结构蛋白(L,2A,2B,2C,3A,3B,3C和3D)。其中3C全长639 bp,编码213个氨基酸。3C蛋白酶是小RNA病毒的共同裂解酶,在多聚蛋白成熟过程中起着极为重要的作用,且在抗病毒药物打靶方面具有一定研究价值。因此,对3C蛋白酶的结构及功能研究进展进行综述很有必要。

自剪切重组麦芽糖结合蛋白-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白在大肠杆菌表达系统中表达、纯化及活性检测

目的利用大肠杆菌表达系统高效表达一种可以自剪切的重组的麦芽糖结合蛋白-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白酶,获得一种可溶性好、酶切特异性强,且在低温下仍保持酶活性的新型基因工程工具酶。方法将编码人鼻病毒3C蛋白酶的遗传微粒克隆入表达载体pRSF-duet,转化大肠杆菌BL21(DE3),经镍柱亲和层析纯化得到人鼻病毒3C蛋白酶。通过自身体内酶切实验进行活性检测。结果人鼻病毒3C蛋白酶在大肠杆菌表达系统中得到了高效的表达,并可特异性识别及剪切人鼻病毒3C蛋白酶酶切位点。结论获得了新型的基因工程工具酶。

FMDV 3C蛋白酶基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB中,构建出重组转移载体pMel-3C。最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞,接种病毒72h后收获细胞,样品经SDS-PAGE和Westernblot证实3C蛋白获得表达,分子量约23kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础。

含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用

目的 :构建含 3C蛋白酶酶切位点的人CD2 2 6 (PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体 ,并进行表达和初步鉴定。方法 :将人CD2 2 6分子的胞膜外区基因 ,克隆入含 3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体 p 3C Ig中。测序证实后 ,转染COS7细胞并进行瞬时表达。表达产物经亲和层析柱纯化 ,并通过免疫荧光染色及 3C蛋白酶酶切反应进行鉴定。结果 :经表达和纯化获得CD2 2 6胞膜外区的Ig融合蛋白。该融合蛋白可与表达于ECV30 4细胞表面的CD2 2 6配体有效结合。同时 ,融合蛋白的Fc段亦经 3C蛋白酶切除 ,从而获得CD2 2 6胞膜外区的真核表达分子。结论 :成功地获得了含有 3C蛋白酶酶切位点的人CD2 2 6分子胞膜外区Ig真核表达产物 ,为进一步对CD2 2 6分子进行结构和功能研究 。

新型抗EV71病毒3C蛋白酶抑制药的设计、合成及其活性

目的:寻找抗EV71病毒新化合物。方法:采用分子模拟技术,以EV71病毒3C蛋白酶活性口袋为靶,设计二肽、三肽,四肽,五肽和六肽等多个系列寡肽化合物,合成对接评分较高的寡肽化合物并进行抗EV71病毒活性筛选。结果:五肽对接评分高于其他系列寡肽,显示五肽化合物与EV71病毒3C蛋白酶有更强的键合力。研究中合成了两个评分较高的五肽化合物25和化合物16,体外抗EV71病毒活性实验显示化合物25活性较强(EC50=1.36μmol·L-1,CC50=211.94μmol·L-1,SI=155.84),而化合物16则无明显活性。结论:五肽化合物25可作为抗EV71病毒新骨架开展进一步研究。

基于结构设计的鼻病毒3C蛋白酶抑制剂的研究进展

人鼻病毒(HRVs)是引起人类普通感冒的主要致病因素,并可导致严重的后遗症。3C蛋白酶是HRVs复制和感染中重要的必需蛋白酶,是目前抗病毒药物的重要选择性靶标。本文对3C蛋白酶的结构与功能及基于结构设计的3C蛋白酶抑制剂研究进展进行了简要概述。

3C蛋白酶表达、纯化及其活性抑制的研究(摘要)

目的3C蛋白酶是催化小RNA病毒前体蛋白中非结构蛋白裂解的关键蛋白酶，具有高度的酶切特异性，其在病毒的生命周期中，起着举足轻重的作用，抑制其催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割，阻断病毒复制，是小RNA病毒药物治疗研究的靶点之一．小RNA病毒科是已知最小的动物RNA病毒，共有7个属，是引起人类严重疾病的病原体，所以对3C蛋白酶的研究为对这些疾病的预防和治疗提供了科学依据和理论基础．

口蹄疫病毒3C蛋白酶切割宿主蛋白PCBP2

口蹄疫病毒(FMDV)3C蛋白酶(3Cpro)能够通过切割翻译起始因子4G(eIF4G)抑制宿主蛋白合成,而宿主多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)的主要功能之一是参与蛋白质合成。本研究通过western blot检测显示,在FMDV感染BHK-21细胞中PCBP2蛋白水平显著降低。为鉴定FMDV 3Cpro是否具有切割PCBP2蛋白的功能,本研究采用免疫共沉淀试验和激光共聚焦检测显示,FMDV 3Cpro和PCBP2在细胞内存在相互作用,并且共定位于细胞质中。进一步研究显示,FMDV 3Cpro能够切割PCBP2,而且具有剂量依赖性。此外,FMDV 3Cpro活性位点突变(H46Y)试验结果表明,FMDV 3Cpro的蛋白酶活性是切割蛋白PCBP2所必需的。FMDV 3Cpro切割PCBP2靶位点序列的鉴定及FMDV 3Cpro切割PCBP2的生物学意义有待深入研究。

口蹄疫病毒3C蛋白酶结构与功能及应用研究进展

口蹄疫病毒(FMDV)3C蛋白酶是FMDV基因组编码中具有酶学活性的病毒产物之一,在FMDV编码蛋白的成熟和子代病毒在宿主细胞体内大量扩增中发挥着重要作用。3C蛋白酶能剪切多聚蛋白,降解特定的蛋白质,是宿主细胞中重要的毒力因子。3C蛋白酶能调控蛋白的转录和翻译,使宿主细胞内的干扰素等多种抗病毒基因低水平表达,使FMDV逃避宿主的天然免疫。论文主要综述了FMDV 3C蛋白酶的结构、生物学功能,并介绍了其在研制新型疫苗中的应用,以期为今后FMDV 3C蛋白酶的研究、新型疫苗的研发提供参考。

小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物

小RNA病毒科是一类大的动物病毒科,小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多个结构蛋白和功能蛋白,3C蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一,3C蛋白酶还可以裂解一些宿主的蛋白,利于病毒的复制。3C蛋白酶结构特点、活性中心、酶切位点如何,裂解的底物功能怎样,是进一步了解3C蛋白酶作用机制的关键。就这些问题进行综述。

HRV143C蛋白酶在大肠杆菌的融合表达及活性检测

目的人鼻病毒3C蛋白酶具有酶切物异性强且在低温下仍保持较强酶活性的特点而被用作工具酶。为大量获得3C蛋白酶,以融合形式在大肠杆菌中高效表达3C蛋白酶。方法将编码HRV 14 3C蛋白酶的cDNA克隆到pGEX4T-1载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经一步GST亲和层析纯化获得GST-3C,再通过体外酶切实验对GST-3C和Thrombin的酶切活性进行比较。结果每升培养产物可获得纯度≥90%的重组融合蛋白约50 mg,重组GST-3C在4℃低温下具有比Thrombin更高的酶活性。结论GST-3C蛋白酶不仅可以应用于融合蛋白的酶切,而且为引入3C蛋白酶识别位点的串联亲和纯化(TAP)系统提供又一种酶切工具。

ApIV 3C蛋白酶抑制剂的虚拟筛选及活性测定

运用Discovery Studio 4.5软件,通过同源建模及分子动力学优化获得柞蚕小吐白水软化病毒(Ap IV)3C蛋白酶的3D结构;通过分子对接对天然产物库进行虚拟筛选,得到1个Ap IV 3C蛋白酶的有效抑制剂3',4',5,7-四羟基异黄酮(Orobol).分子对接和分子动力学(MD)模拟结果进一步证明Orobol能稳定结合于Ap IV 3C蛋白酶的结合口袋处.体内外的Ap IV病毒抑制实验结果表明,Orobol具有良好的抗病毒活性.

以柯萨奇B3病毒3C蛋白酶为靶点的体外药物筛选模型的建立及应用

建立以柯萨奇B组3型病毒3C蛋白酶(CVB3-3C)为靶点的药物筛选模型,并筛选新型抑制剂。使用原核表达模型实现CVB3-3C蛋白酶体外重组表达。经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析纯化获得高纯度CVB3-3C蛋白。应用荧光共振能量转移法检测蛋白酶活性,建立药物筛选模型。对768种化合物进行筛选,获得了2种对CVB3-3C蛋白酶有较强抑制作用的化合物(MDCE-A008和MDCE-A043),IC50值分别为(60.61±6.26)μmol/L、(105.7±14.88)μmol/L。建立的CVB3-3C蛋白酶药物筛选模型为获得有效抑制剂提供了技术保证。

人鼻病毒3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

人鼻病毒3C蛋白酶具有高特异性,且在低温条件下具有较高酶活,目前已被商品化.在大肠杆菌中利用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签可促进人鼻病毒3C蛋白酶的可溶性表达.将人鼻病毒3C蛋白酶的DNA编码序列克隆到pRK792载体上,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,获得MBP-LEVLFQGP-6x His-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白,随后通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白.用该产物切割纯化的MBP-LEVLFQGP-6x His-木聚糖酶融合蛋白,可获得木聚糖酶并用底物平板检测其活性.实验结果表明人鼻病毒3C蛋白酶能够在大肠杆菌中表达,并且能特异性地在其底物识别序列进行切割,从而移除MBP标签,获得仅带有6x His的人鼻病毒3C蛋白酶.该酶可以特异性地去除木聚糖酶融合蛋白中的MBP标签,获得有活性的木聚糖酶.利用MBP标签能够促进人鼻病毒3C蛋白酶可溶性表达,且人鼻病毒3C蛋白酶的活性不受影响,有利于一些不稳定的蛋白在低温下的标签去除和纯化.

小RNA病毒3C蛋白酶研究进展

小RNA病毒科病毒包括数目众多的小RNA病毒,其中很多小RNA病毒是人畜重要的病原体。不同种属的小RNA病毒的3C蛋白酶具有典型的G-X-C-G基序和Cys-His-Asp/Glu催化中心;小RNA病毒3Cpro完成P1区VP2~VP3、VP3~VP1;P2区的2A^2B、2B^2C以及整个P3区成熟剪切;小RNA病毒多聚前体蛋白3Cpro成熟剪切分析显示,3Cpro作用底物具有明显的Q-G/S/A/V/H/R和E-S/G/R/M喜好性及种属特异性;固有免疫应答重要配体分子TRIF、MAVS、IRF3、IRF7和NEMO的3Cpro酶切位点预测显示,不同配体分子具有数目各异的可能酶切位点,其中TRIF和NEMO的3Cpro可能作用位点具有多样性。上述问题的探究,为基于小RNA病毒3Cpro的广谱抗病毒药物研制和小RNA病毒免疫逃逸机制提供资料。