口蹄疫病毒P1+3CD基因重组腺病毒的构建

目的构建包含有O型口蹄疫病毒(FMDV)强毒结构蛋白(P1)基因及弱毒非结构蛋白(3CD)基因的重组腺病毒,为进一步研制FMD活载体疫苗奠定基础。方法通过RT-PCR方法扩增得到含有FMDV P1、3CD编码区的目的基因。P1基因经BglⅡ和XhoⅠ,3CD基因经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后与经BglⅡ和XbaⅠ双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAd Track-CMV连接。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体在大肠杆菌内同源重组获得重组腺病毒质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观测细胞病变及报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒。结果在pAd Track-CMV载体中成功克隆了P1+3CD基因,并与腺病毒骨架载体在大肠杆菌中实现了同源重组。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞后可观测到典型的细胞病变与绿色荧光蛋白的表达。结论成功获得了含有FMD P1+3CD基因的重组腺病毒,为FMD活载体疫苗的研制提供了依据。

1例PIK3CD基因突变致PI3Kδ过度活化综合征患儿的护理经验分析

目的分析1例PIK3CD基因突变致PI3Kδ过度活化综合征(APDS)患儿的护理经验。方法通过列举APDS的临床资料,结合文献复习,发现护理问题,给予针对性的护理措施。结果经过本次住院治疗、护理后,患儿腹围由之前的101.5 cm降至87.5 cm,咳嗽较前减轻,水肿消退,腹水明显减少,体重未减轻,患儿生存质量较前有所提高。结论PIK3CD基因突变致APDS为罕见遗传免疫缺陷病,护理参考资料较少,积累此类患儿的护理经验有助于患儿住院期间生存质量的提高。

肠道病毒71型P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒的构建及表达

目的构建肠道病毒71型(EV71)P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,并检测3CD蛋白酶的切割作用和表达产物的抗原性。方法采用RT-PCR法从阜阳分离的EV71中扩增P1和3CD基因,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-P1-3CD、pShuttle-CMV-P1和pShuttle-CMV-3CD;经同源重组获得重组腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD,分别转染293细胞,RT-PCR法检测目的基因的转录,免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果3种重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明构建正确;RT-PCR检测表明,3个重组腺病毒均已转录目的基因mRNA;免疫荧光检测仅观察到rAd-P1-3CD表达产物具有特异性,而rAd-P1、rAd-3CD未能检测到特异性表达产物。结论已成功构建EV71P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,表达产物具有EV71特异抗原性,提示P1产物只有在被3CD蛋白酶切割后才体现抗原性。

PIK3CD基因突变致PI3Kδ过度活化综合征1家系报告并文献复习

目的分析PIK3CD基因突变致PI3Kδ过度活化综合征(APDS)的临床特点、发病机制及治疗方法并复习文献。方法回顾性分析2017年12月就诊于郑州大学附属儿童医院院呼吸内科一APDS1家系临床资料,采用二代测序法对先证者进行全外显子测序,并对同卵双胞胎姐姐、父母家系成员行一代Sanger验证。结果先证者,10岁6个月女童,患中耳炎、反复呼吸道感染、便血,免疫性血小板减少性紫癜;查体:听力下降、肝脾大;辅助检查示支气管扩张、肺部淋巴结肿大、IgM增高、CD4^(+)T淋巴细胞数量减少及CD4^(+)/CD8^(+)T淋巴比例倒置。同卵双胎姐姐及其母亲也有反复呼吸道感染,支气管扩张等表现及体征。基因检测示先证者及同卵双胎姐姐PIK3CD基因存在c.3061 G>A(p.E1021K)错义杂合突变,来源于母亲。结论APDS1是一种罕见的原发性免疫缺陷综合征,主要临床特征是反复呼吸道感染、淋巴结肿大、肝脾肿大、支气管扩张、发育迟缓、IgM增高、CD4^(+)/CD8^(+)T淋巴比例倒置,易感染EB、CMV病毒,可进展为淋巴瘤等恶性疾病等。PIK3CD基因c.3061 G>A(p.E1021K)错义杂合突变是本家系患儿遗传学病因。

CD3ζ链基因在脐带血T细胞及其CD4＋和CD8＋T细胞亚群中的表达特点

目的了解脐带血T细胞及其CD4+和CD8+T细胞亚群的信号传导分子CD3ζ基因的表达特点。方法采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测60例脐带血单个核细胞和12例纯化脐带血CD4+及CD8+T细胞的CD3ζ基因的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用相对定量公式:2-△Ct×100%,计算CD3ζ基因相对mRNA表达量,60例健康成人作为对照。并根据荧光定量PCR熔解曲线特点和序列分析了解CD3ζ基因突变情况。结果全部脐带血和健康成人外周血单个核细胞均表达CD3ζ基因,不同个体CD3ζ基因表达量有所差异,脐带血T细胞CD3ζ基因相对mRNA表达量为6.7%±5.56%,CD4+和CD8+T细胞的CD3ζ基因相对mRNA表达量分别为6.74%±2.0%和6.88%±1.76%,三者CD3ζ基因表达量均明显高于健康成人(P=0.000,P=0.034,P=0.000)。序列分析结果显示尚未发现国外文献所报道的ζ链剪接异构体。结论本研究率先报道了脐带血T细胞及其CD4+和CD8+T细胞亚群的CD3ζ基因mRNA的表达水平,为进一步了解脐带血T细胞免疫学特点提供新的基础资料。

接触苯及苯中毒工人外周血T细胞中CD3ζ基因的表达与分析

目的了解接触苯及苯中毒工人外周血中T细胞信号传导分子CD3ζ基因表达水平。方法利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR分别检测28例苯接触工人、45例苯中毒工人和30例正常人外周血单个核细胞的CD3ζ基因表达情况,以β2微球蛋白基因(β2m)作为内参,根据相对定量公式(2-△△Ct)计算苯接触、苯中毒工人与正常人CD3ζ基因表达差异倍数。结果根据相对定量公式(2-△△Ct)分析显示苯接触工人外周血CD3ζ基因表达存在3种情况不表达2例(7%)、表达上升18例(64%)和表达下降8例(29%),与正常人CD3ζ基因相比表达上升和下降的倍数分别是19.68±25.24和0.67±0.32。苯中毒工人外周血CD3ζ基因表达情况表达上升31(69%)和表达下降14例(31%),与正常人CD3ζ基因相比表达上升和下降的倍数分别是31.50±29.18和0.52±0.25。与苯接触相比,45例苯中毒工人中18例(40%)CD3ζ基因表达上升,27例(60%)CD3ζ基因表达下降,上升和下降的倍数分别是12.04±4.35和0.29±0.23。结论首次报道接触苯及苯中毒工人中CD3ζ基因表达水平的变化,接触苯及苯中毒工人CD3ζ基因表达低下可能与细胞免疫功能缺陷有一定关系。

CML病人外周血T细胞CD3基因表达模式变化

在我们前期研究发现慢性髓系白血病(CML)病人中T细胞受体信号传导分子CD3ζ基因表达下调的基础上,本研究进一步分析病人外周血中全部4种CD3γδεζ基因的表达模式特点,以深入了解病人的T细胞免疫中信号转导的变化。利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测17例初诊慢性期CML病人外周血单个核细胞中CD3γ、δ、ε和ζ链的表达水平,以β2微球蛋白基因(β2MG)作为内参照,采用相对定量公式:2-△Ct×100%,计算CD3分子各亚单位的相对mRNA表达量,以17例健康成人外周血作为对照。结果表明:CML中CD3γ、δ、ε基因表达水平分别为2.344%,0.515%和3.516%(中位数),与健康对照组比较(3.093%,0.853%和2.302%)并没有显著性差异(p=0.072,p=0.190,p=0.615),而CML中CD3ζ链基因的表达水平(0.395%)则明显低于健康对照组(1.538%)(p<0.001)。在CML中4种CD3分子表达水平模式依次为CD3ε>CD3γ>CD3δ>CD3ζ,而对照组中则为CD3γ>CD3ε>CD3ζ>CD3δ。结论:本研究首先提供了CML病人中CD3各基因表达模式情况,显示以CD3ζ为主的TCR信号分子的表达缺陷,4种CD3链分子的表达水平模式也发生变化。

淋巴细胞白血病患者CD3基因表达模式的变化

目的:了解T细胞受体信号传导分子CD3γδεζ基因在T和B细胞白血病病人中的表达特点。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测32例淋巴细胞肿瘤病人:急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)12例、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)9例、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)11例及10例健康人外周血单个核细胞中CD3各亚单位表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用公式2-△Ct×100%计算CD3分子γ、δ、ε和ζ链表达水平。结果:B-ALL病人的CD3分子γ、δ和ε链表达中位数水平分别为4.29%,0.67%,17.8%,与健康对照组相比,无显著性差异(P>0.05);而CD3γ链表达水平为0.99%,与健康对照组相比,显著降低(P=0.02)。B-CLL病人的CD3δ、ε基因的表达分别为0.52%,6.72%,与健康对照组相比,无显著性差异(P>0.05);而CD3γ、ζ基因(2.72%,0.77%)则比健康人明显下降(P<0.05)。在T-ALL病人中,CD3分子γ、δ和ε的表达(32.99%,12.9%,61.56%)与健康对照组相比,均明显上升(P<0.05),而CD3ζ的表达量为4.17%,与健康人无显著性差异(P=0.44)。B-ALL、B-CLL病人和健康对照组的CD3分子各链的表达模式依次为CD3ε,CD3γ,CD3ζ,CD3δ,而T-ALL病人的表达模式顺序为CD3ε,CD3γ,CD3δ,CD3ζ。结论:在B细胞白血病中CD3各基因的表达水平多为降低,其变化可能与机体T细胞免疫缺陷相关。而在T细胞白血病中CD3各基因表达水平增加可能是白血病性T细胞一个特点。

多发性骨髓瘤患者外周血CD3ε基因的表达特点

目的:建立荧光定量PCR法检测CD3ε链表达水平的方法,了解多发性骨髓瘤(MM)T细胞信号传导分子CD3ε基因的表达特点。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测22例MM患者及22例正常人外周血单个核细胞CD3ε基因的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,22例健康人作为对照,采用相对定量公式:2-△Ct×100%,计算MM患者CD3ε基因相对mRNA表达量。结果:MM患者和正常人外周血单个核细胞均表达CD3ε基因,具体表达量呈现很大的个体差异性。MM患者CD3ε基因mRNA相对表达量最高为39.78%,最低为0.48%,正常人CD3ε基因mRNA相对表达量最高为5.15%,最低为0.01%。MM患者CD3ε基因表达量明显高于正常人(P<0.05)。结论:成功建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测CD3ε链表达水平的方法,率先报道了多发性骨髓瘤中CD3ε基因高表达的特点,为了解多发性骨髓瘤T细胞免疫学特点提供新的资料。

CD_(44)v3基因蛋白在恶性卵巢肿瘤中的表达及其临床意义

目的 :探讨CD4 4v3基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达情况及其临床意义。方法 :用免疫组织化学S -P法 ,检测 41例恶性卵巢肿瘤、2 0例良性卵巢肿瘤和 2 1例正常卵巢组织中CD4 4v3基因蛋白的表达情况并分析相关的临床病理因素。结果 :1)CD4 4v3表达阳性率恶性组显著高于良性组和正常组 ;2 )有转移者CD4 4v3阳性率显著高于无转移者 ,转移灶阳性率高于原发灶 ;CD4 4v3阳性表达者近期疗效比阴性者差 ;3)CD4 4v3阳性表达率与临床期别有一定关系 ,但与病理类型、组织学级别无关。结论 :1)CD4 4v3与肿瘤的发生、发展相关 ;2 )CD4 4v3与卵巢恶性肿瘤的浸润和转移相关 ,可以作为预测肿瘤转移潜能指标 ;3)CD4 4v3与近期疗效有关 ,可作为评估预后的指标。

G-CSF动员前后外周血T细胞CD3基因表达水平变化特点

目的:分析G-CSF动员前后外周血T细胞中CD3分子的γ,δ,ε和ζ链基因表达水平变化特点,以深入了解G-CSF对T细胞信号转导的影响。方法:利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测17例健康供者G-CSF动员前后外周血单个核细胞中CD3γ、δ、ε和ζ链的表达水平,以β2微球蛋白基因(β2MG)作为内参照,采用相对定量公式:2-ΔCt×100%,计算CD3分子各亚单位的相对mRNA表达量。结果:G-CSF动员前后4种CD3基因表达水平模式均为CD3ζ>CD3ε>CD3δ>CD3γ。供者G-CSF动员后CD3ζ和ε链基因表达水平(2.194%,0.867%)明显低于G-CSF动员前(7.615%,1.839%),动员前后比较存在显著差异(P=0.031,P=0.009);动员前CD3δ和γ基因平均表达水平分别为1.097%和0.271%,与动员后比较(0.333%和0.077%)并没有显著性差异(P=0.093,P=0.070)。G-CSF动员前与动员后CD3ζ基因表达水平存在正相关性(rs=0.576,P=0.016);G-CSF动员前与动员后CD3γ、δ和ε基因表达水平均不存在显著相关性(P=0.726,P=0.236,P=0.198)。G-CSF动员前与动员后CD3ζ基因以及G-CSF动员后CD3δ基因表达水平与供者年龄均有负相关性(rs=-0.549,P=0.023;rs=-0.679,P=0.003;rs=-0.570,P=0.017)。结论:本研究结果提示G-CSF动员可能主要影响TCR信号通路中的CD3ζ和ε链基因的表达,而整体的CD3基因表达模式未发生改变。

PIK3CD基因杂合突变所致新表型——系统性红斑狼疮

原发性免疫缺陷病(primary immunodeficiency disease,PID)临床特征主要包括感染、自身炎症及自身免疫、过敏、肿瘤等。在常染色体显性遗传(autosomal dominant,AD)引起的PID中,可分为由功能丧失性突变(loss-of-function mutation,LOF)和功能获得性突变(gain-of-function mutation,GOF)[1].

抗人膀胱癌/抗CD_3双功能基因抗体对LAK细胞增殖和细胞毒作用的体外研究

目的 探讨抗人膀胱癌 /抗 CD3双功能基因抗体对 LAK细胞增殖和增强细胞毒的作用。方法 采用 1 2 5I- Ud R释放试验等检测方法。结果 双功能抗体显著提高 LAK细胞与肿瘤细胞结合率 ,促进淋巴细胞增殖 ,加入双功能抗体后 ,L AK细胞对肿瘤细胞细胞毒性明显增加。结论 抗人膀胱癌 /抗 CD3双功能基因抗体可以大大促进 LAK细胞增殖和增加细胞毒性作用 ,为膀胱癌的治疗提供新的方法。

PIK3CD功能获得性突变致慢性EB病毒感染1例并文献复习

目的报道1例PIK3CD基因功能获得性(GOF)突变致慢性EB病毒(EBV)感染患儿,探讨该病临床表现及基因突变特点。方法收集患儿的临床资料,提取患儿及直系亲属外周血DNA,通过全外显子组测序技术检测其基因突变情况,并检索相关文献进行复习。结果患儿自2岁始反复出现呼吸道感染,伴肝脾淋巴结肿大,反复出现种痘样皮疹;血清EBV抗体水平显著升高,淋巴组织活检提示T淋巴细胞增殖性改变,EBV编码RNA(EBER)阳性。13岁时患儿血液中免疫球蛋白水平显著升高伴多种自身抗体阳性。基因检测提示PIK3CD基因杂合突变c.3061G>A(p.E1021K),文献复习提示该突变为GOF突变。结论PIK3CD基因GOF突变可导致EBV易感及EBV慢性感染,临床表现为淋巴组织增生、特征性皮疹出现。该病患儿亦可表现为血液中免疫球蛋白水平的显著升高,可能与自身免疫反应所致自身抗体大量形成有关。

血液肿瘤病人TCR/CD3信号缺陷及其治疗策略

T细胞免疫缺陷导致机体监测恶性转化细胞不力,是血液肿瘤发生发展的重要原因,T细胞受体信号分子CD3复合物尤其是CD3ζ表达下降或缺失严重影响T细胞的活化功能,本文主要综述近年对血液肿瘤中T细胞受体信号传导分子CD3ζ的缺陷及其可能的治疗策略的研究进展。

T细胞CD3ζ3'-UTR区域突变类型的特点

目的:分析CD3ζ3'-UTR区域的突变/SNP的类型情况,深入了解中国汉族健康人CD3ζ3'-UTR的突变/SNP特点.方法:利用RT-PCR,T载体克隆以及核苷酸测序等技术分析20例健康人外周血单个核细胞中CD3ζ3'-UTR突变/SNP突变类型等情况.结果:20例健康人外周血单个核细胞中CD3ζ3'-UTR区域共检出21种突变/SNP.CD3ζ3'-UTR区域的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶均发生不同频率的突变,依次为37.36%,16.48%,40.66%和5.50%.腺嘌呤的突变频率显著高于胸腺嘧啶和胞嘧啶(P均为0.00);鸟嘌呤的突变频率显著高于胸腺嘧啶和胞嘧啶(P均为0.00);胸腺嘧啶的突变频率显著高于胞嘧啶(P=0.02).CD3ζ3'-UTR区域缺失、转换和颠换突变检出频率依次为21.98%,35.16%和42.86%,缺失突变的频率显著低于转换和置换突变(P=0.05,P=0.02),转换/颠换比值为0.82.结论:首次报道中国健康人外周血单个核细胞中CD3ζ3'-UTR区域突变类型特点,T>C转换突变在中国汉族健康人CD3ζ3'-UTR区域的高频出现影响转换/颠换比.

CD3D基因与卵巢癌免疫浸润的相关性及其预后价值

目的探讨CD3D基因在卵巢癌(OC)组织中的表达,对卵巢癌肿瘤微环境中免疫浸润的影响及其预后价值。方法利用GEPIA数据库分析CD3D基因在包括卵巢癌在内的多种肿瘤中的表达情况;收集2011年1月至2017年12月山西白求恩医院治疗的卵巢癌患者223例及因子宫平滑肌瘤切除全子宫+双侧附件的患者25例,采用免疫组化SP法检测卵巢癌及正常卵巢组织中CD3D基因的蛋白表达,比较CD3D基因表达与卵巢癌患者临床病理特征之间的关系;cBioportal数据库分析CD3D基因的共表达基因;DAVID数据库分析CD3D基因及其共表达基因KEGG功能富集通路;Kaplan Meier plotter数据库分析CD3D基因的预后价值;TIMER2.0数据库分析CD3D基因表达与卵巢癌中主要免疫细胞的免疫浸润关系。结果与正常卵巢组织相比,CD3D蛋白在卵巢癌组织中高表达(P<0.05),且在卵巢癌不同FIGO分期、残留病灶是否达R0间的表达差异均有统计学意义(均P<0.05)。Kaplan-Meier-Plotter预后分析提示CD3D基因高表达的患者具有更高的生存率(P<0.05)。表达基因的富集分析提示,该组基因主要富集于Th1与Th2细胞分化通路、T细胞受体信号通路、Th17细胞分化通路、原发性免疫缺陷通路、PD-L1和PD-1免疫检查点通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路等。Timer数据库分析发现CD3D基因与肿瘤微环境中B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和树突状细胞的浸润程度呈正相关(均P<0.05)。结论 CD3D基因在卵巢癌组织中高表达,其可能通过调整免疫相关通路影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润而改变患者预后。