3D细胞培养在细胞生理学研究中的应用进展

3D细胞培养技术是生命科学中发展最快的实验技术之一。随着细胞成像和数据分析的发展以及新的细胞支架的使用,3D模式逐渐成为主流的细胞培养方式。这种培养已被证明更接近体内细胞的原始状态,能为很多研究提供有价值的细胞材料。通过介绍现阶段3D细胞培养方法、优势、现有的支架材料以及在模拟生理学相关进程中的应用,为未来的细胞生理学研究提供参考。

基于3D细胞培养系统的肺癌类干细胞的分离和鉴定

目的:本研究建立三维细胞培养方法(3D)以分离和鉴定肺癌类干细胞,并与二维细胞培养方法(2D)比较,初步探讨该方法在评价肺癌体外增殖、凋亡、侵袭和药物反应性方面的应用。方法:将人肺腺癌细胞系A549以1×104个/孔的细胞与RPMI1640和伊格尔基础培养基(basal medium of eagle,BME)制成细胞悬液,培养7 d,收集细胞采用流式细胞仪进行类干细胞表型检测,以及体外成球、耐药性、体内成瘤等干细胞功能鉴定,并将3D与2D细胞培养的A549细胞进行比较。结果:细胞表型检测证明3D系统培养的A549细胞中CD44和CD326阳性比例升高,CD24阳性比例下降,细胞体外成球率显著升高(28.50%±1.17%vs.8.67%±0.80%,P<0.01)对顺铂耐药性显著提高。加药后48 h为58.17%±2.19%vs.33.27%±5.76%(P<0.01),加药后72 h为41.70%±5.81%vs.27.30%±4.25%(P<0.01),体内成瘤时间显著缩短[(20.75±0.85)d vs.(60.25±1.49)d,P<0.01]。结论:3D培养的肺癌细胞中获得更高比例的类干细胞样细胞,具有体内成瘤快、体外成克隆团率高、耐药性提高的特征。

基于3D细胞水平的药物筛选模型

药物筛选是新药研发过程中最为重要的阶段之一,而选择合适的筛选模型可以有效缩短时间、降低成本和提高效率.进入21世纪以来,药物筛选技术正朝着快速、高效的细胞水平筛选方面发展.以活细胞作为靶点的筛选模型,具有与生理内环境接近、微型化和高通量化等优点.而3D细胞模型较2D细胞模型,具有更接近机体环境的优势,是目前正在高速发展的一项新技术.主要论述了几种疾病的3D细胞药物筛选模型及其近年来的应用,为后续研究者们选择筛选模型提供参考.

基于生物打印3D细胞微流控芯片的常用中药注射液肝脏安全性再评价

目的建立更贴近生理状态的肝模型对中药注射液进行肝毒性评估。方法建立了一个通过3D打印和微流控芯片组合利用人源细胞的类肝脏系统,对3种市售中药注射液进行肝毒性评价。结果该微流控芯片系统中的内皮细胞可长期培养并模拟血管内皮剪切力。生物打印的3D肝微球经14 d培养后仍能保持正常的白蛋白(ALB)和细胞色素P4503A4酶(CYP3A4)的表达。中药注射剂的肝毒性评价结果表明基于3D打印的类肝脏芯片比2D细胞模型更准确。结论本法准确可信,可为中药肝毒性检测提供新方法。

肿瘤3D细胞模型在体外药敏实验中的应用

为解决肿瘤个体化治疗中体内外模型差异的问题,明晰体外模型对药敏检测的影响。实验在体外建立肿瘤3D细胞模型,通过ATP生物荧光法(ATP-TCA)检测3D肿瘤细胞中ATP的含量,间接反映3D肿瘤细胞对化疗药物5-FU和紫杉醇的敏感性。同时,通过Live/Dead细胞成像实验进一步研究化疗药物对3D肿瘤细胞的杀伤作用。研究发现化疗药物5-FU和紫杉醇均可抑制HepG2和A549肿瘤3D细胞的生长,且紫杉醇对HepG2 3D细胞的抑制作用明显强于5-FU。药物敏感性评价结果显示,HepG2 3D细胞对化疗药物紫杉醇中度敏感,对5-FU不敏感。A549 3D细胞对紫杉醇和5-FU均中度敏感。Live/Dead细胞成像结果进一步证实了PTX对HepG2 3D细胞具有明显的毒性。本实验为体外药敏检测提供了新思路。

化学生物学综合创新实验——基于3D细胞模型的基因转染

该文通过体外构建三维(3D)细胞培养模型,探讨基于3D细胞模型的基因转染条件。实验选用甲基纤维素半固体培养体系,建立了体外3D细胞模型。并采用聚乙烯亚胺(PEI,25 k Da)介导荧光标记质粒和增强绿色荧光蛋白报告基因的转染,激光扫描共聚焦三维重构技术进一步分析基因在3D细胞模型中的传输及表达情况。结果表明,当PEI和质粒DNA的复合比为10时,PEI介导的基因在3D细胞模型中具有良好的传输能力和一定的表达能力。本研究结果可为3D细胞模型在基因转染方面的应用提供实验依据。

3D细胞培养和类器官在骨髓源性间充质干细胞成骨分化中的研究进展

类器官(organoids)来源于自体的组织及干细胞,是通过体外3D培养后形成的细胞团块,这种团块具有原始组织及器官的三维结构,并保留了相对应的功能和遗传特征。由于其具有模拟特定机体器官的发育和疾病发生发展的潜能,这一模型在多种药物的筛选和分子机制研究中拥有更多的优势。近年来,已有实验表明骨髓源性间充质干细胞(BMSCs)通过3D培养及成骨分化可以形成骨的类器官,并可以植入机体发挥特定的作用。这种骨类器官模型的构建,不仅可以为骨质疏松等相关疾病研究提供更多方法,还在骨组织移植及修复等组织工程学中发挥重要作用。本文就BMSCs成骨分化的类器官相关3D模型研究进展作一综述,为BMSCs成骨分化的类器官的基础和临床研究提供更多理论依据和思路。

3D细胞培养在药物研发中的研究进展

3D培养模型的引入是细胞培养技术的一个里程碑,随着新型支架、基质的发明与应用及细胞成像和分析系统的日新月异,三维细胞培养可模拟体内微环境而获得传统2D细胞培养所没有的优势,已在基础研究、干细胞及组织工程等领域崭露头角。本文通过回顾3D细胞培养在药敏实验、药物筛选、药物研发、临床应用中的贡献,从药物效应、药物代谢及药物敏感性着手,枚举3D细胞培养通过改变基因/蛋白质差异表达来进行药物研发,并对其应用趋势、潜在优势和不足作一综述,为基础研究和临床应用提供理论依据。

3D细胞环在医学研究中的应用

3D细胞培养比传统二维培养能更好模拟人体内环境,增加细胞间通讯,还原疾病状态,使生物医学的研究更接近人体真实情况。3D细胞环是一种无支架3D细胞培养结构,具有规则的外形、可夹取便于移植等特点,在生物医学诸多领域都有广泛应用。本文作者结合自身目前已有的工作基础,就3D细胞环在干细胞分化、组织移植和再生、糖尿病治疗、肿瘤研究、药物检测、以及研究热放疗生物学效应、肿瘤动物建模、疾病模型构建等领域的潜在应用做一综述,旨在推动国内3D细胞培养技术的发展,以及促进医学研究由二维向3D模式的跨越。

3D细胞培养在阿尔茨海默病研究中的应用

2D细胞培养的细胞在体外环境下随着增生会逐渐丧失原来的性状;动物模型实验繁琐,价格昂贵;而3D细胞培养模型可在一定程度上弥补动物模型和2D细胞模型的缺陷,越来越受到大家重视。2014年数据报道阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)65岁以上人群发病率在5.14%,我国AD患者2016年已达800万,但该病的发病机制尚未明确,对AD的研究一直是热点及难点。本文将简单介绍2D细胞培养和3D细胞培养,并对3D细胞培养近些年在AD研究方面的应用作一综述。

3D细胞培养的研究进展和应用前景

细胞因其提供大量的信息而成为科研中重要的研究材料之一,2D细胞培养中生长的细胞为探索细胞机制提供了大量的基础知识,但仍存在一定缺陷,如细胞形态与体内环境不同,胚胎结构的塌陷及不利于观察,组织结构的复杂等。体外2D细胞培养无法建立有效的体内微环境和细胞间的相互作用,从而潜在地诱导细胞形态和基因表达的变化,一定程度上扭曲细胞的行为和生物学功能。为了获得具有正常形态,行为和体内功能的细胞,3D细胞培养技术因此而生。3D细胞培养是将具有3D结构不同材料的载体与不同种类的细胞在体外共培养,使细胞能够在具有3D立体空间结构的载体中迁移、生长等生物活性,构成3D的细胞-载体复合物。目前3D细胞培养可应用于多种领域,包括肿瘤微环境、类器官、微载体等。因此,本文通过介绍各种3D细胞培养模型以及3D细胞培养的载体,对3D培养技术目前进展进行总结,为后续3D培养技术的发展提供依据。

用于构建神经变性疾病模型的3D细胞培养研究进展

神经变性疾病是全球面临的重大疾病之一,传统的动物模型、2D细胞模型、脑片培养模型对理解疾病机制过程是有益的,但为了切实模拟患者大脑复杂神经网络,体现血脑屏障功能变化和炎症反应,基于3D细胞培养技术构建体外模型具有更大的潜能。本综述将介绍常见神经变性疾病现有模型、3D细胞培养体系、体外模拟这些疾病的障碍和当前在该领域的研究进展。

2D和3D培养肺细胞释放VOCs的质谱检测比较研究

挥发性有机物(volatile organic compounds,VOCs)作为一种潜在的癌细胞标志物被广泛研究。目前,体外细胞多采用二维(two-dimensional,2D)贴壁培养方式,这与体内肿瘤细胞呈三维结构存在差别。本实验分别以肺癌细胞A549和肺上皮细胞BEAS-2B为例,构建三维(three-dimensional,3D)培养模型,并以2D模型和培养基作为对照,利用固相微萃取气相色谱-质谱(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)法检测细胞释放的VOCs。通过非靶向统计分析细胞在2D和3D培养中释放的差异性VOCs,其中A549细胞有4种(乙酸、1-吡咯啉、4-甲基庚烷、2,4-二甲基-1-庚烯),BEAS-2B细胞也有4种(乙醇、1-吡咯啉、4-甲基庚烷、2,4-二甲基-1-庚烯)。与2D模型相比,这些VOCs在3D模型中的释放量增加了2.11~12.81倍。此外,还讨论了差异性VOCs可能的生化来源以及在2D/3D模型中释放量差异的可能原因。本工作证明了3D培养在体外细胞VOCs检测方面具有广阔的应用前景,有望成为癌症标志物筛查有价值的研究平台。

猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析

【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。

肿瘤细胞3D无支架培养技术研究进展及其在药效评价中应用

作为三维(3D)细胞培养技术之一的3D无支架培养技术,其广泛应用于肿瘤3D细胞模型的构建之中。了解当前肿瘤细胞3D无支架培养技术的应用情况,以及肿瘤3D细胞模型的构建成果对于抗癌药物的研发与评价很重要。本文介绍了构建肿瘤3D细胞模型的超低吸附着板培养法、悬滴培养法、磁悬浮培养法和旋转式细胞培养系统以及它们的局限性,并简述了肿瘤3D细胞模型用于药效评价的新进展,以期为肿瘤3D细胞模型的构建及抗癌药的药效评价提供参考。

甲基丙烯酰化明胶3D培养的CAR-T细胞靶向杀伤脑胶质瘤细胞的研究

目的研究在甲基丙烯酰化明胶中培养的CAR-T细胞功能及活性的变化,以及用GelMA为载体,负载缓释CAR-T细胞的可行性。方法基因编辑靶向表皮生长因子受体(EGFR)的第二代CAR-T细胞,制备负载CAR-T的甲基丙烯酸酯明胶,通过水凝胶成胶过程图像、储存及损耗模量验证水凝胶成功制备;使用荧光显微镜荧光成像、流式细胞分析验证CAR-T的成功转染;应用CCK-8实验检测水凝胶的生物相容性;构建共培养模型,利用Elisa试剂盒、细胞毒性LDH试剂盒检测上清液中释放的细胞因子、LDH,检测CAR-T是否成功活化,评估CAR-T细胞杀伤效应。结果荧光显微镜下观察转染第4天的CAR-T细胞,见CAR-T细胞聚集成团并散发绿色荧光;第9天流式细胞术示CD3+T细胞的慢病毒转染率为42.2%,CD8+T细胞:CD4+T细胞约为1∶1,CAR-T细胞成功制备。CCK8实验示水凝胶无毒性。Elisa试剂盒示上清液中细胞活性因子IFN-γ释放量显著增多,提示CAR-T细胞识别EGFR抗体后,可成功活化。当效靶比为1∶1时,U87细胞毒性为71.75%,而U87 EGFRvⅢ细胞毒性为18.13%。结论甲基丙烯酸酯化明胶负载培养的CAR-T细胞活性良好,功能正常,可设计使用该水凝胶负载递送CAR-T细胞,实现CAR-T细胞的精确靶向治疗。

辣蓼黄酮正丁醇部位对PRV感染3D4/2细胞氧化应激相关因子水平的影响

【目的】探究辣蓼黄酮正丁醇部位(N-butanol fraction of Polygonum hydropiper flavonoids,FNB)对猪伪狂犬病毒(Pseudoabies virus,PRV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞)氧化应激相关因子的影响,旨在初步分析FNB的抗氧化效果。【方法】采用10-1至10-10浓度PRV体外感染猪肾细胞(PK15细胞),计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID50);将3D4/2细胞分为BC组、DMSO组、PRV组、FNB 1、FNB2和FNB3组,BC组用DMEM培养液处理,其余各组用感染复数(multiplicity of infection,MOI)=0.1 RPV处理,孵育2 h后,PRV组添加DMEM培养液,DMSO组及FNB1、FNB2、FNB3组分别添加0.05%DMSO及12.5、25、50μg/mL FNB的DMEM培养液。培养4、8、12、24 h后,分别收取各组细胞培养液上清和细胞,通过试剂盒测定细胞培养液上清中一氧化氮(NO)的含量、细胞内活性氧(ROS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性和丙二醛(MDA)的含量。【结果】PRV的TCID50为10-8.25/0.1 mL;与BC组相比,PRV组上清中NO水平在4、8 h时极显著降低(P<0.01),在12、24 h时极显著升高(P<0.01),细胞内ROS在4 h时显著降低(P<0.05),8~24 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),iNOS和XOD活性在8~24 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),MPO活性在4~24 h时显著升高(P<0.05),MDA含量在4 h时显著降低(P<0.05),12~24 h时显著升高(P<0.05)。与PRV组相比,FNB2组NO含量在4~8 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),在12 h时显著降低(P<0.05),FNB3组在24 h时极显著升高(P<0.01);细胞内ROS水平在4 h时极显著升高(P<0.01),8~24 h时极显著降低(P<0.01);FNB1组iNOS活性在4 h时显著升高(P<0.05),3个FNB组iNOS活性在8~24 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),MPO和XOD活性在4~24 h时显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),MDA含量在4 h时升高,8 h时FNB2、FNB3组MDA含量显著降低(P<0.05),24 h时FNB1、FNB2组MDA含量显著降低(P<0.05)。【结论】FNB可以通过干预氧化应激相关因子的分泌调节细胞氧化应激水平,维持氧化与抗氧化的平衡,结果可为辣蓼黄酮正丁醇部位的开发应用提供理论依据。

体外构建3D细胞压力培养模型研究压力对增生性瘢痕成纤维细胞的作用

目的采用Flexcell-5000C压力系统和鼠尾I型胶原构建3D细胞压力培养模型,在体外细胞水平探讨压力对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)的作用。方法胶原酶消化法分离培养原代HSFb,采用Flexcell-5000C压力系统和鼠尾I型胶原体外构建HSFb 3D培养模型。实验分为对照组(未施压)、10 mmHg压力组、20 mmHg压力组、30 mmHg压力组。通过免疫荧光观察不同压力下HSFb的表型变化;Ki-67/Edu免疫荧光染色检测HSFb增殖能力;Annexin-V-PI流式双染检测HSFb凋亡;PI流式单染检测HSFb细胞周期;划痕实验检测HSFb迁移能力。数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果激光共聚焦显微镜下可见HSFb表型随着压力增大逐渐向正常皮肤成纤维细胞(FB)转变,且在30 mmHg压力下最显著;Ki-67/Edu免疫荧光染色显示:HSFb增殖能力与压力值成反比,20 mmHg、30 mmHg组较对照组HSFb增殖能力显著降低(F=10.61,P=0.0037),而其余各组组间HSFb增殖能力差异无统计学意义(P>0.05);Annexin-V-PI流式双染显示:相比于对照组、10 mmHg压力组、20 mmHg压力组及30 mmHg压力组HSFb早期凋亡率显著升高,差异有统计学意义(F=103.8,P<0.0001),而10、20 mmHg压力组HSFb早期凋亡率较对照组差异无统计学意义(P>0.05);PI流式单染结果显示:相比于对照组、10 mmHg压力组及20 mmHg压力组,30 mmHg压力组G0/G1期HSFb百分比显著升高(F=21.58,P=0.0003),S期及G2/M期HSFb百分比显著下降(F=93.89、54.11,P<0.001、=0.0066);相比于对照组,10 mmHg及20 mmHg G0/G1期HSFb百分比显著升高,S期及G2/M期HSFb百分比显著下降(P<0.05);而20 mmHg与10 mmHg相比,HSFb细胞周期差异无统计学意义(P>0.05);划痕实验结果显示,与对照组相比,30 mmHg压力组HSFb迁移能力明显下降(t=10.66,P=0.004)。结论基于Flexcell-5000C压力系统和鼠尾I型胶原构建的3D细胞压力培养模型便捷稳定,压力值实时可调可控,成功验证了压力能够抑制HSFb增殖、迁移,且促进其凋亡及向Fb转分化的作用,并初步证实了30 mmHg为最佳压力值,为HS压力治疗提供了新的研究思路和体外模型。

3D干细胞培养在牙髓再生研究中的应用

3D细胞培养是一种模拟人体内细胞生长环境的体外培养方式,使细胞保持原有的立体形态,有利于细胞内基因的表达和信号转导。3D干细胞培养作为其中一个重要的研究方向,主要应用于器官体外培养和组织再生领域。在牙髓再生研究中,干细胞经2D培养后,存在细胞接触抑制、基因表达受限以及部分生物学功能缺失的局限性,而3D培养可增强干细胞自我更新和特异性分化的能力,再生神经血管化的牙髓-牙本质复合体,再生效果明显优于2D培养。本文将介绍3D细胞培养的研究现状,总结分析3D干细胞培养在牙髓再生研究中的优势、应用及展望,为牙髓再生中干细胞培养条件和再生效果的优化提供理论依据。

基于3D肿瘤模型和网络药理学的威灵仙粗提物体外抗肺癌药效及潜在作用机制研究

目的基于3D肿瘤细胞模型和网络药理学方法,研究威灵仙体外抗肺癌的药效及潜在作用机制。方法使用人肺癌细胞系A549建立体外3D肺癌模型,以依托泊苷作为阳性对照组,对水、30%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、90%乙醇提取得到的威灵仙粗提物进行体外药效学研究。通过多种数据库筛选出药物和肺癌的核心靶点,并采用ELISA试剂盒检测信号通路中的关键因子。结果挖掘出威灵仙活性成分33个,核心成分3种,为Hederagenin、2-Deoxy-D-Ribono-1、beta-sitosterol,排名靠前的靶点为CASP3、PTGS2、IL6、TNF,推测为核心靶点。GO功能富集共筛选得到171个条目,KEGG通路富集共筛选出56条通路。ATP检测结果显示各2D、3D细胞模型处理组IC_(50)值分别为:依托泊苷(41.98±1.15),(118.63±3.93)μmol·L^(-1);水提取物(0.89±0.04),(6.37±0.78)mg·mL^(-1);30%醇提物(0.64±0.02),(5.40±0.78)mg·mL^(-1);60%醇提物(0.45±0.01),(4.30±1.16)mg·mL^(-1);70%醇提物(0.37±0.02),(3.24±0.85)mg·mL^(-1);90%醇提物(0.60±0.03),(5.46±1.47)mg·mL^(-1)。HE染色结果显示,肿瘤细胞核皱缩及胞质减少程度强弱顺序为70%醇提物>依托泊苷处理组>60%醇提物>90%醇提物>30%醇提物>水提物。免疫细胞结果显示,相比于对照组,各给药组均有肿瘤细胞核皱缩且P53表达量显著减少(P<0.05)。ELISA结果显示,威灵仙70%醇提物和60%醇提物均对Bax-Bcl-2-Caspase-3信号通路产生显著影响(P<0.05)。结论各组威灵仙粗提物均对人A5493D模型有一定的活性抑制作用,其中70%醇提物效果最佳,60%醇提物次之,这种抑制作用可能与其上调Bax、Caspase-3含量,下调Bcl-2含量相关,即威灵仙粗提物可能具有抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡的作用。