塞内卡病毒3D蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备

A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种能引起猪特发性水疱病(Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)的病原体。SVA 3D蛋白主要编码RNA依赖的RNA聚合酶,与病毒的RNA复制密切相关。为制备3D蛋白的多克隆抗体,试验构建SVA 3D蛋白基因截短片段的原核表达质粒pET-32a-3D,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经诱导表达、纯化获得重组蛋白。用重组蛋白免疫新西兰大白兔后收集血清,获得了SVA 3D蛋白的多克隆抗体。将SVA感染BHK-21细胞,用制备的3D蛋白的抗体进行IFA和Western blot检测,结果显示,用制备的3D蛋白抗体能检测在SVA感染细胞中表达的3D蛋白,说明制备的3D蛋白多克隆抗体与3D蛋白反应性良好,为后续SVA致病机制的深入研究提供材料储备。

口蹄疫病毒3D蛋白在体外的表达纯化及二级结构分析

口蹄疫(FMD)是严重影响全球农业经济的高度传染的毁灭性的疫病.3D蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)编码的RNA聚合酶,参与病毒RNA的复制.利用PCR扩增得到了FMDV的3D基因片段,然后将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pETFM3D.转化宿主菌BL21(DE3)后,利用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western boltting分析结果表明,得到了稳定、过量表达的可溶性的3D蛋白质.目的蛋白质经NI亲和层析柱一步纯化就达到95%,再经Q-sepharose柱纯化后达到97%.通过圆二(CD)色谱测定和计算3D蛋白质在不同的pH(2、4、6、8和10)和不同的温度下(25～85℃)的二级结构.上述结果表明,表达的可溶性3D蛋白质具有高表达、易纯化和稳定性好等特点.

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。

口蹄疫病毒3D蛋白对表位多肽免疫效果调节作用的研究

为了研究口蹄疫病毒(FMDV)重组蛋白3D对病毒表位抗原的免疫调节功能,笔者克隆了Asia 1型FM-DV的3D蛋白基因,并实现了重组蛋白在E.coli的表达及纯化。将纯化的重组蛋白3D与重组抗原按1∶2混合,并与等体积的ISA 206佐剂混合,制备免疫原(每毫升含50μg3D重组蛋白和100μg重组抗原)。按每只豚鼠1mL剂量经后腿肌肉多点接种250～300g健康豚鼠5只,免疫后28d用相同剂量的免疫原进行加强免疫;分别于免疫后0、21、28和42d采血检测血清中和抗体效价,并进行淋巴细胞增殖试验。于加强免疫后14d用103的50%豚鼠感染量(GPID50)的Asia1型FMDV进行攻击,评价免疫原效力。同时,设立重组抗原/ISA 2061(每毫升含100μg重组抗原)、Asia 1型灭活疫苗(1mL)和PBS/ISA 206(1mL)作为对照。结果表明,3D重组蛋白能显著提高表位重组抗原的中和抗体水平和淋巴细胞的增殖水平(P<0.05),但与灭活疫苗组没有差别(P>0.05);PBS对照组未检测到中和抗体和淋巴细胞增殖。结果提示,重组蛋白3D可显著提高重组表位抗原的免疫潜能,是一种十分重要的免疫调节蛋白,对开发新型疫苗具有重要的意义。

口蹄疫病毒3D蛋白C端Th表位的重组表达及免疫功能鉴定

为获得含有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白,根据口蹄疫3DC端160个氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET28a,构建原核表达质粒pET28a-C160,并将重组质粒转化BL21(DE3),0.5mmol/L IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,在25ku处有一条明显的蛋白表达条带,且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析,结果显示,表达蛋白全部以包涵体形式存在,经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见:用纯化的3DC160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗,免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。

口蹄疫病毒3D蛋白促进TLR3介导的Ⅰ型干扰素产生

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫病毒感染宿主引起一系列严重的炎症反应,而TLR3通路是介导细胞炎性反应的主要途径之一。为研究口蹄疫病毒蛋白对TLR3通路的影响,本研究首先用双荧光素酶报告系统筛选影响TLR3通路的FMDV蛋白;接着用Q-PCR试验验证筛出来的候选蛋白对TLR3通路下游基因表达水平的影响;并用免疫共沉淀试验验证与候选蛋白有相互作用的TLR3通路蛋白;最后用Western blot试验检测候选蛋白对TLR3通路下游分子磷酸化水平的影响。双荧光素酶报告系统结果显示,口蹄疫病毒3D蛋白促进TLR3通路介导的Ⅰ型干扰素的产生并呈剂量依赖性,Q-PCR试验表明,3D能够促进TLR3通路下游基因表达水平;免疫共沉淀试验表明,FMDV 3D与TLR3有相互作用;Western blot试验进一步显示,过表达3D能够促进TLR3下游分子的磷酸化水平。综上,口蹄疫病毒3D蛋白能促进TLR3介导的Ⅰ型干扰素的产生,从而调控天然免疫反应。

肠道病毒71型3D蛋白研究进展

目的 EV71感染可引起婴幼儿手足口病,甚至导致死亡。近年来由EV71引发的手足口病一直呈上升的流行趋势。目前中国对于手足口病的疫苗研究已进入临床试验阶段,但EV71引起的重症手足口病的发病机制仍不明确。3D蛋白主要负责病毒的复制过程,是抗病毒药物的靶点之一。本文就EV71的3D蛋白的结构功能及针对其作为靶点的抗病毒药物作一综述。

口蹄疫病毒3D蛋白对表位多肽免疫效果调节作用的研究

为了研究口蹄疫病毒（FMDV）重组蛋白3D对病毒表位抗原的免疫调节功能．笔者克隆了Asia1型FMDV的3D蛋白基因，并实现了重组蛋白在E．coli的表达及纯化。将纯化的重组蛋白3D与重组抗原按1：2混合，并与等体积的ISA206佐剂混合，

FMDV 3D基因真核表达质粒的构建、表达及对Ⅰ型IFN信号通路的作用

本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用。根据GenBank序列合成3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞,Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测3D蛋白在细胞内的表达及定位。通过双荧光素酶报告基因(Luciferase)、Real-time PCR、TCID50等试验检测HEK-293T细胞中过表达3D蛋白对水疱性口炎病毒(Versicular stomatitis virus,VSV)诱导的Ⅰ型IFN信号通路的影响。结果显示,真核表达质粒pXJ41-Myc-3D构建成功;3D蛋白在HEK-293T细胞中表达,大小约为55 kDa,主要定位在细胞核中;3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN-β启动子活性和IFN-β mRNA水平,促进了VSV的复制。本研究为深入探究3D蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路的作用机制奠定了基础。

肠道病毒71型2A、3C、3D蛋白的研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)感染是引起神经系统紊乱、肺水肿、肺出血等严重疾病的主要原因。非结构蛋白2A、3C、3D是EV71在宿主细胞内完成复制和存活的基础,具有不同于肠道病毒其他成员的结构和作用机制。2A和3C蛋白可抑制宿主细胞蛋白的表达,从而促进细胞凋亡,3C蛋白还可抑制天然免疫,3D蛋白与病毒的耐高温和高度变异适应性有关。一些小分子物质可在病毒入侵的不同阶段抑制EV71感染。本文就2A、3C、3D蛋白在EV71复制过程中的结构与功能特点以及一些小分子物质在病毒复制中的抑制作用作一综述。

肠道病毒71型3D蛋白潜在毒力位点的序列分析

目的分析不同临床严重程度感染者肠道病毒71型的3D蛋白氨基酸序列,了解潜在毒力相关变异位点。方法从NCBI数据库下载不同临床严重程度C4亚型EV71感染者3D区核苷酸序列;对推导的氨基酸序列进行比对和分析,查找不同临床严重程度病毒感染者在3D蛋白存在差异有统计学意义的氨基酸位点。结果共下载序列113株,其中来自于重症及死亡患者序列共67株、轻症患者序列46株。分析显示病毒3D区的256位和370位氨基酸残基,在不同临床严重病例中的分布差异有统计学意义,其中部分重症患者在256位为非异亮氨酸,部分轻症患者在370位为非甘氨酸。结论 C4亚型EV71病毒的3D区256位和370位氨基酸的变异,可能与病毒毒力相关。

中国流行的两个进化分支C4亚型EV71病毒3D蛋白氨基酸变异分析

目的分析不同进化分支肠道病毒71型(EV71)的3D蛋白氨基酸序列的差异,了解潜在毒力相关变异位点。方法从GenBank和实验室收集C4基因亚型EV71全基因序列,以VP1序列做进化分析,统计分析C4a和C4b两进化分支EV71病毒的3D蛋白氨基酸序列。结果共收集病毒序列301株C4型EV71毒株,其中C4a序列293株、C4b序列8株。不同进化分支中3D区有22个氨基酸残基分布有统计学意义。结论两种进化分支C4亚型EV71病毒的3D蛋白,共有22个位点氨基酸变异,其生物学意义有待进一步研究。

昆明市EV71病毒分离株3D蛋白酶序列特征、病毒增殖特性分析

目的比较昆明市住院与门诊病例来源的10株EV71病毒分离株3D蛋白酶基因核苷酸及编码氨基酸序列的差异性与病毒毒力之间的关系。方法对分离自昆明市的10株EV71病毒3D蛋白酶基因核苷酸测序,利用Bioedit及Mega 6软件对测序结果进行序列比对及遗传特性分析。选取6株(住院病例分离株、门诊病例分离株各3株)绘制病毒增殖动力学曲线,取其中2株(住院及门诊病例来源各1株)病毒接种至Vero细胞进行空斑形成试验,比较不同病毒株形成的空斑形态大小。结果对10株EV71分离病毒株的3D蛋白酶基因进行核苷酸测序并构建进化树,5株住院病例分离株间遗传距离较近,在进化树上单独成为一簇;住院病例病毒分离株与门诊病例病毒分离株的氨基酸序列在140、197、299位点存在差异;住院病例病毒株在较短时间达到增殖高峰,空斑试验中形成的蚀斑直径大于门诊病例分离株。结论不同来源的EV71病毒分离株3D蛋白酶基因核苷酸序列及编码氨基酸序列存在差异,该差异与EV71病毒的增殖特性及毒力具有一定相关性。

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆,直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体,用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定。结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选,共获得5株抗pET28a-3D的mAb,其亚类鉴定3株为IgG1,2株为IgG2b,初步判定所得5株mAb识别2个不同表位。Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDVO/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合,免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白。结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb,为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础。

肠道病毒71型不同病毒株3D蛋白对细胞损伤的作用

目的 比较肠道病毒71型（EV71）SDLY11株和SDLY107株3D蛋白对细胞的损伤程度.方法 EV71病毒株SDLY11和SDLY107分别取自轻症手足口病患儿和重症手足口病患儿.反转录PCR扩增目的基因11-3D-Flag和107-3D-Flag,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,连接产物转化至大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定.重组质粒转染人横纹肌肉瘤（RD）细胞,间接免疫荧光试验和蛋白质印迹检测3D蛋白表达,乳酸脱氢酶（LDH）检测3D蛋白导致的细胞损伤,噻唑蓝（MTT）比色法测定3D蛋白对细胞增殖的影响,Annexin-V/Pl双染法测定3D蛋白引起的细胞凋亡.各组间两两比较方差齐采用LSD-t检验,方差不齐采用Dunnett T3检验.结果 反转录PCR扩增获得1 400 bp片段,酶切鉴定重组质粒后分别获得1 400 bp和5 400 bp片段,测定序列与目的基因一致.间接免疫荧光试验观察到特异性荧光,蛋白质印迹显示目的蛋白相对分子质量为55×10^3.LDH结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的吸光度（A）490值高于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为0.790±0.048和0.641±0.018,差异有统计学意义（t=5.14,P〈0.05）,SDLY11株3D蛋白引起的细胞膜损伤情况较SDLY107株3D蛋白严重.MTT比色法结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的A570值低于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为1.028±0.020和1.081±0.002,差异有统计学意义（t=3.31,P〈0.05）,SDLY11株3D蛋白对细胞增殖活性的影响大于SDLY107株3D蛋白.Annexin-V/PI双染法结果显示,SDLY11株3D蛋白转染组和SDLY107株3D蛋白转染组的细胞凋亡百分比分别为（1.471±0.246）%和（1.465±0.237）%,差异无统计学意义（t=0.04,P=0.973）.结论 与SDLY11株3D蛋白相比,SDLY107株3D蛋白引起的细胞损伤程度较轻微,且对细胞增殖活性的影响较弱,更有利于病毒在细胞内的复制.

维生素D_3上调蛋白1在哮喘嗜酸粒细胞中的表达及其与细胞活化的关系

目的:探讨维生素D3上调蛋白1(VDUP1)在哮喘患者外周血嗜酸粒细胞(EOS)中的表达及与EOS活化的关系。方法:实验分为对照组、哮喘发作组和缓解组。抽取外周静脉血15mL,计算诱导痰EOS%,测定第1秒最大呼气量占预计值百分比(FEV1.0%)和最大呼气中期流速占预计值百分比(PEF%);ELISA法检测血清嗜酸粒细胞阳离子蛋白(ECP)浓度。RT-PCR及Western blotting方法检测外周血EOSVDUP1表达情况。IL-5与EOS共孵育,检测EOSVDUP1表达情况,ELISA法检测培养上清液ECP浓度。结果:哮喘发作组外周血EOSVDUP1表达均显著低于正常组及缓解组,与诱导痰EOS%及血清ECP浓度呈明显负相关;缓解组基因表达与正常对照组无显著差异,与上述指标也无明显相关。IL-5刺激下,EOSVDUP1表达明显降低,同时伴上清ECP明显升高。结论:哮喘发作时外周血EOSVDUP1表达明显下调,EOSVDUP1表达与血清ECP及诱导痰EOS%呈明显负相关,IL-5促进EOS活化可能与VDUP1通路有关。

硫氧还蛋白结合蛋白-2／维生素D3上调蛋白1在哮喘病人外周血嗜酸性粒细胞的表达(英文)

目的探讨硫氧还蛋白结合蛋白／维生素D3上调蛋白1(VDUP1)在不同时期哮喘病人嗜酸细胞中的表达及其与哮喘临床症状的关系。方法抽取正常自愿受试者14例,急性发病未经任何治疗的16例轻到中度哮喘病人和通过吸入糖皮质激素而处于哮喘缓解期的35例病人的外周静脉血15 ml进行外周血嗜酸细胞计数和诱导痰嗜酸细胞计数,随后行肺功能检查测定FEV1．0％和PEF％。分离纯化静脉血嗜酸细胞,提取总RNA。RT-PCR同时扩增特异性片段 VDUP1和内参β-Actin。取10μl反应物进行1％琼脂糖凝胶电泳,用Gel-Pro软件分析凝胶成像,测定VDUP1和β-Actin灰度值,求VDUP1／β-Actin比值,并比较不同组别之间VDUP1表达的变化,分析VDUP1／β-Actin比值与诱导痰嗜酸细胞、FEV1．0％、PEF％的相关性。结果急性期未经治疗的哮喘病人嗜酸细胞(0．314±0．242)与正常人比较(0．532± 0．279)显著降低,而经吸入糖皮质激素处于缓解期哮喘病人嗜酸细胞VDUP1／β-Actin比值(0．612±0．381)与正常对照组无显著差异。在急性发作未经治疗哮喘组嗜酸细胞VDUP1表达与FEV1．0％(r=0．587,P=0．046)和PEF％(r=0．563． P=0．033)呈正相关,而与诱导痰嗜酸细胞计数呈负相关关系(r=0．436,P=0．049)。结论嗜酸细胞VDUP1的表达与哮喘嗜酸细胞活化相关,并影响哮喘病人的临床症状。

降低蛋白激酶D3的表达和活性增强前列腺癌细胞DU-145对依托泊甙的敏感性

目的探讨蛋白激酶D3(protein kinaseD3,PKD3)是否会影响依托泊甙对激素抵抗性前列腺癌(hormonal refractory prostate cancer,HRPC)的生长抑制。方法在HRPC细胞系DU-145中瞬时转染PKD3的siRNA,Western blot检测细胞中内源性PKD3的表达变化;siRNA转染48h后,分别以0、30、70、100、300μmol/L的依托泊甙处理对照siRNA、siRNA-PKD3-1、siRNA-PKD3-2转染的DU-145细胞24h,并以细胞活力测定观察敲定内源性PKD3的表达有无影响依托泊甙对DU-145的生长抑制;利用PKC单一抑制剂、PKC-PKD双重抑制剂处理DU-145细胞,以观察二者是否增强DU-145对依托泊甙的敏感性。结果 Westernblot证实siRNA-PKD3的转染敲低DU-145细胞内源性PKD3的表达;细胞活力测定表明,在非特异性siRNA(si-CTL)转染的DU-145细胞中,依托泊甙剂量依赖地抑制DU-145细胞的生长,而敲低PKD3的表达不仅可显著抑制DU-145的生长(P<0.01),还可显著增强依托泊甙对DU-145生长的抑制(P<0.01);Go6976(PKC-PKD的双重抑制剂)可明显抑制前列腺癌DU-145细胞生长(P<0.01),而Go6983(单一的PKC抑制剂)则仅对DU-145的生长起微弱抑制作用。结论 PKD3的表达和活性可增强前列腺癌DU-145细胞对依托泊甙的敏感性,提示可作为抗前列腺癌药物设计的潜在靶点之一。

胃腺癌组织维生素D_3上调蛋白1表达与核因子-κB活性关系研究

目的探讨胃腺癌组织维生素D3上调蛋白1(VDUP1)表达情况及其与核因子-κB(NF-κB)活性关系。方法分别取胃腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织,病理检查确诊,凝胶迁移率变动分析(EMSA)测NF-κB活性,RT-PCR检查VDUP1表达。结果胃腺癌组织的NF-κB活性(10 701.0±3 529.4)与癌旁组织(7 961.5±1601.2)比较,差异有显著性(P<0.01);胃腺癌组织VDUP1表达减少,与癌旁组织VUDP1表达情况比较,差异有显著性(P<0.01)。结论胃腺癌组织VDUP1表达降低,NF-κB活性升高,VDUP1表达与NF-κB活性呈负相关。VDUP1对NF-κB活性可能具有负调节作用。

肠道病毒71型3D蛋白结构与功能研究进展

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是儿童常见的急性传染病。肠道病毒71型(enterovirus,EV71)是HFMD的主要病原体之一,在我国HFMD的发病率较高,主要感染对象是婴幼儿,EV71感染也是目前导致HFMD重症患儿的最主要的病原体。我国于2008年5月2日将HFMD列为丙类法定传染病。HFMD的致病机理尚未明确,目前还未研发出能够有效治疗此类病毒的药物。EV71中的非结构蛋白3D能够催化病毒基因组的复制和转录,是开发抗EV71病毒药物的重要靶标之一。本文就EV713D蛋白的结构、功能作一综述,为抗病毒药物的研发提供参考。