猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析

【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。

辣蓼黄酮正丁醇部位对PRV感染3D4/2细胞氧化应激相关因子水平的影响

【目的】探究辣蓼黄酮正丁醇部位(N-butanol fraction of Polygonum hydropiper flavonoids,FNB)对猪伪狂犬病毒(Pseudoabies virus,PRV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞)氧化应激相关因子的影响,旨在初步分析FNB的抗氧化效果。【方法】采用10-1至10-10浓度PRV体外感染猪肾细胞(PK15细胞),计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID50);将3D4/2细胞分为BC组、DMSO组、PRV组、FNB 1、FNB2和FNB3组,BC组用DMEM培养液处理,其余各组用感染复数(multiplicity of infection,MOI)=0.1 RPV处理,孵育2 h后,PRV组添加DMEM培养液,DMSO组及FNB1、FNB2、FNB3组分别添加0.05%DMSO及12.5、25、50μg/mL FNB的DMEM培养液。培养4、8、12、24 h后,分别收取各组细胞培养液上清和细胞,通过试剂盒测定细胞培养液上清中一氧化氮(NO)的含量、细胞内活性氧(ROS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性和丙二醛(MDA)的含量。【结果】PRV的TCID50为10-8.25/0.1 mL;与BC组相比,PRV组上清中NO水平在4、8 h时极显著降低(P<0.01),在12、24 h时极显著升高(P<0.01),细胞内ROS在4 h时显著降低(P<0.05),8~24 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),iNOS和XOD活性在8~24 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),MPO活性在4~24 h时显著升高(P<0.05),MDA含量在4 h时显著降低(P<0.05),12~24 h时显著升高(P<0.05)。与PRV组相比,FNB2组NO含量在4~8 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),在12 h时显著降低(P<0.05),FNB3组在24 h时极显著升高(P<0.01);细胞内ROS水平在4 h时极显著升高(P<0.01),8~24 h时极显著降低(P<0.01);FNB1组iNOS活性在4 h时显著升高(P<0.05),3个FNB组iNOS活性在8~24 h时显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),MPO和XOD活性在4~24 h时显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),MDA含量在4 h时升高,8 h时FNB2、FNB3组MDA含量显著降低(P<0.05),24 h时FNB1、FNB2组MDA含量显著降低(P<0.05)。【结论】FNB可以通过干预氧化应激相关因子的分泌调节细胞氧化应激水平,维持氧化与抗氧化的平衡,结果可为辣蓼黄酮正丁醇部位的开发应用提供理论依据。

马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞活性及炎症相关因子的影响

首先通过MTT法检测马尾藻多糖对3D4/2细胞活性的影响,然后用ELISA法检测炎症相关因子。试验结果,PCV-2感染3D4/2细胞后明显降低细胞活性,马尾藻多糖25、50、100、200、400μg/m L处理后,均能提高感染细胞的活性;PCV-2感染3D4/2细胞后均能显著提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎症因子的水平,马尾藻多糖处理后,25、50、100、200、400μg/m L均能在一定程度上降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1的分泌水平,且其中25、50μg/m L的效果最明显。结果表明,马尾藻多糖具有较好的体外抗炎作用,且其抗炎作用机制可能与其抑制炎症因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1等的分泌有关。

猪圆环病毒Ⅱ型体外诱导3D4/2细胞炎症模型的建立

【目的】通过对猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)体外感染3D4/2细胞浓度、时间与细胞炎症水平进行探讨,建立PCV2体外感染3D4/2细胞炎症反应模型,以期为后期药物调控PCV2诱发3D4/2细胞炎症反应的研究奠定基础。【方法】将3D4/2细胞分为对照组及10^(0)、10^(-1)、10^(-2)和10^(-3)PCV2感染组,每组3个重复。对照组用DMEM培养,各PCV2感染组用不同稀释倍数PCV2液培养,2 h后均更换为含5%胎牛血清(FBS)的DMEM维持液进行培养,培养4、8、12和24 h后分别收集细胞及细胞上清液。采用Griess法检测一氧化氮(NO)水平,DCFH-DA荧光探针法检测活性氧(ROS)水平,酶标法检测还原型谷胱甘肽(GSH)水平,分光光度法检测黄嘌呤氧化酶(XOD)和髓过氧化物酶(MPO)活性,ELISA法测定白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10、γ干扰素(IFN-γ)、IL-8、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)以及环氧合酶1(COX-1)和COX-2的分泌水平。【结果】10^(0)至10^(-3)PCV2作用4、8、12和24 h均能够成功感染3D4/2细胞。与对照组相比,10^(0) PCV2在感染3D4/2细胞4、8、12、24 h后ROS水平均极显著升高(P<0.01),10-1至10-3PCV2感染3D4/2细胞8、12、24 h后ROS水平显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01);10^(0)至10-3PCV2感染3D4/2细胞8、12、24 h后,细胞内NO浓度及MPO活性显著提高(P<0.05),细胞上清液中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8和MCP-1水平及COX-1活性均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),其中10^(0) PCV2感染3D4/2细胞后,各炎症因子水平上升最显著,且随着时间的延长,NO浓度逐渐升高,XOD活性逐渐降低。【结论】PCV2可诱导3D4/2细胞炎症反应,且10^(0) PCV2体外感染3D4/2细胞4~12 h是建立炎症模型的最佳条件。

Calculation of the Isotope Shifts on 5S1／2→4D3／2,5／2 Transitions of ^87,88Sr^＋＊

A simple method is applied to calculating the isotope shifts (ISs) on 5S1/2 → 4D3/2,5/2 transitions of 87,88Sr+. First we have calculated the ISs of lower transitions on a series of alkali-like systems such as B2+, Ca+ and Ba+, which are in agreement with other works. Then the ISs on 5S1/2 → 4D3/2,5/2 transitions of 87,88Sr+, which are useful to study the Sr+ optical frequency standard, are evaluated.

山豆根多糖对猪圆环病毒Ⅱ型感染猪肺泡巨噬细胞炎性因子水平的影响

试验旨在研究山豆根多糖(SSP)对猪肺泡巨噬细胞3D4/2感染猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus virusⅡtype,PCV2)后炎性因子水平的影响。本试验设空白对照组、PCV2感染组、脂多糖(LPS)对照组和3种浓度(100、200和400μg/mL)的山豆根多糖组,采用PCV2体外感染猪肺泡巨噬细胞,在培养液中分别加入100、200和400μg/mL山豆根多糖培养24 h后收集样品,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-8(IL-8)水平和胞内环氧合酶-1(COX-1)、环氧合酶-2(COX-2)的酶活性,实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、COX-2基因及其蛋白表达。结果显示,PCV2感染猪肺泡巨噬细胞后极显著提高了MCP-1、IL-8分泌水平和细胞内COX-1、COX-2酶活性(P<0.01),iNOS、COX-2 mRNA和蛋白表达水平均极显著提升(P<0.01);100、200、400μg/mL山豆根多糖处理后,3D4/2细胞MCP-1、IL-8分泌水平和细胞内COX-1、COX-2酶活性均显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),其中400μg/mL山豆根多糖处理后效果最显著,细胞内iNOS、COX-2基因mRNA表达水平同样显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01);100、200、400μg/mL山豆根多糖处理后,显著或极显著抑制了由PCV2诱导的iNOS蛋白表达量的增加(P<0.05;P<0.01),经200、400μg/mL山豆根多糖处理后显著抑制COX-2蛋白表达量的增加,400μg/mL山豆根多糖处理效果最佳。综上所述,山豆根多糖可在一定程度上抑制PCV2感染所引起的促炎症因子mRNA表达的升高及其蛋白的表达,起到一定的缓解炎症的作用。

猪伪狂犬病病毒诱导猪肺泡巨噬细胞氧化应激和炎症反应研究

旨在通过猪伪狂犬病病毒(PRV)感染猪肺泡巨噬细胞(3D4/2),观察PRV感染对猪免疫细胞氧化应激和炎性反应的影响,为进一步研究PRV感染致病机制和防控药物的开发奠定基础。采用猪肾脏细胞(PK-15)扩增PRV,测定PRV TCID_(50),观察PRV感染3D4/2细胞病变及检测病毒扩增情况,测定PRV感染对3D4/2细胞活性的影响,将PRV分别以MOI=0.000111、0.00111、0.0111、0.111、1.11、11.1、111和1110接入3D4/2细胞,接毒2 h后弃上清液,继续培养4、8、12、24、48 h后测定细胞内或上清液中炎性因子水平和相关酶活性。结果显示,PRV可感染3D4/2细胞并形成明显细胞病变;当MOI=11.1、111和1110时,PRV感染3D4/2细胞48 h后显著抑制了细胞活性(P<0.05);与空白对照组相比,不同剂量PRV感染3D4/2细胞于不同时间点能够显著或极显著升高IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、NO和ROS炎性因子水平及COX-1、COX-2、XOD、MPO和iNOS酶活性(P<0.05或P<0.01),极显著下调细胞内GSH含量水平(P<0.01)。结果表明,PRV能够感染3D4/2细胞,并且改变了3D4/2细胞的氧化还原状态,诱导3D4/2细胞产生炎症反应。将PRV按照MOI=0.111体外感染3D4/2细胞8 h~48 h是建立PRV感染3D4/2细胞氧化应激及炎症模型的最佳条件。