IL-35亚基EBI3、P35对系统性硬化症小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响

目的:研究白细胞介素(IL)-35亚基对系统性硬化症(SSc)小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响。方法:将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组、SSc模型组、SSc+EB病毒诱导的基因3抗体(SSc+EBI3 mAb)组和SSc+IL-12A P35抗体(SSc+P35 mAb)组,除正常对照组外,其余各组小鼠注射博来霉素构建SSc模型。造模后,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35mAb组分别腹腔注射100μL的EBI3 mAb、P35 mAb。采用苏木精—伊红(HE)染色观察小鼠皮肤和肺组织炎症病理改变,Masson染色观察肺纤维化程度,免疫组化法检测皮肤和肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-35、IL-6、IL-10水平。结果:与对照组相比,SSc模型组小鼠皮肤厚度增加,肺纤维化评分、皮肤和肺组织炎症评分、血清IL-35水平及皮肤和肺组织α-SMA表达水平均升高,血清IL-10水平降低(均P<0.05)。与SSc模型组比较,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35 mAb组小鼠皮肤厚度增加,血清IL-10水平及皮肤、肺组织α-SMA表达水平升高,血清IL-35水平降低(均P<0.05);SSc+P35 mAb组小鼠肺纤维化评分较SSc模型组升高(P<0.05)。与SSc+EBI3 mAb组相比,SSc+P35 mAb组小鼠血清IL-10水平升高(P<0.05)。结论:IL-35可能通过EBI3和P35亚基抑制SSc小鼠模型皮肤和肺部的纤维化病变,而对炎症无明显作用,P35亚基在肺纤维化中的作用更明显。

甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性

为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶(I3EB99)的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21(DE3)表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化,并利用生物信息学方法研究凝乳酶的三维空间立体结构。结果表明,重组表达的甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度为0.7 mg/mL,凝乳活力为(15870±1.17)SU/g,蛋白水解活力为(263.81±0.94)U/g,凝乳活力与蛋白水解活力比值为60.16,符合干酪生产加工的要求。结构特性研究表明,经重组表达后的甲醇芽孢杆菌凝乳酶呈现疏水特性,具有跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋少于β-折叠,在分离纯化过程中结构不稳定易降解,该凝乳酶与来自甲醇芽孢杆菌的一种未知蛋白酶是同源蛋白,高级结构与PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A相似度最高。通过对甲醇芽孢杆菌凝乳酶结构特性的研究,为深入分析该凝乳酶作用机理及其功能性奠定了理论基础。

TGF⁃β1对炎症状态下人牙周膜成纤维细胞的调控作用

目的探讨转化生长因子⁃β1(transforming growth factor⁃β1,TGF⁃β1)对在牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖(lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,Pg⁃LPS)刺激模拟炎症状态下的人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)的调控作用。方法获取hPDLFs并进行免疫组化鉴定,通过qRT⁃PCR与CCK⁃8确定Pg⁃LPS的刺激浓度。将hPDLFs分成4组:空白对照组,单纯100μg/mL Pg⁃LPS;低浓度组,1 ng/mL TGF⁃β1+100μg/mL Pg⁃LPS;中浓度组,10 ng/mL TGF⁃β1+100μg/mL Pg⁃LPS;高浓度组100 ng/mL TGF⁃β1+100μg/mL Pg⁃LPS。CCK⁃8检测细胞增殖情况;划痕实验与Transwell小室实验检测hPDLFs细胞迁移能力;流式细胞术检测hPDLFs的细胞周期;qRT⁃PCR检测hPDLFs的转录因子叉头盒p3(forkhead/winged helix transcription⁃al factor p3,Foxp3)、白细胞介素6(interleukin⁃6,IL⁃6)及EB病毒诱导基因3(Epstein⁃Barrvirus⁃induced gene 3,EBI3)mRNA表达;Western blot检测hPDLFs的Foxp3、IL⁃6及EBI3蛋白表达。结果免疫组化鉴定显示抗波形丝蛋白阳性及抗角蛋白阴性;Pg⁃LPS浓度为100μg/mL时,hPDLFs中IL⁃6 mRNA表达相比空白对照组显著上升(P<0.0001)且细胞增殖能力下降(P<0.0001),所以选择100μg/mL Pg⁃LPS用于模拟炎症状态。10、100 ng/mL TGF⁃β1能提高炎症状态下hPDLFs的增殖能力(P<0.0001);1、10、100 ng/mL TGF⁃β1能促进炎症状态下hPDLFs的迁移能力(P<0.0001);1、10、100 ng/mL TGF⁃β1可加快炎症状态下hPDLFs的细胞周期(P<0.0001);1、10、100 ng/mL TGF⁃β1可抑制炎症状态下hPDLFs的IL⁃6基因和蛋白表达量(P<0.0001),1、10 ng/mL TGF⁃β1可提高炎症状态下hPDLFs的EBI3基因及蛋白表达量(P<0.0001),1、10 ng/mL TGF⁃β1可提高炎症状态下hPDLFs的Foxp3基因表达量,10 ng/mL TGF⁃β1可提高Foxp3蛋白表达量(P<0.05)。结论TGF⁃β1可促进炎症状态下hPDLFs的增殖及迁移能力、上调EBI3表达,可能与转录因子Foxp3表达有关。

EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达

目的探讨EB病毒核抗原(EBNA)3C对Gemin3基因表达的影响。方法共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞。依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响。结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少。结论 EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平。

白细胞介素27对树突状细胞和单核巨噬细胞影响的研究进展

白细胞介素27(IL-27)是一种IL-6/IL-12家族细胞因子,主要由激活的抗原提呈细胞产生,通过激活Janus激酶-信号转导子与转录激活子(JAK-STAT)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)等信号通路发挥作用。最初认为IL-27能够促进1型辅助T(Th1)细胞、1型调节性T(Tr1)细胞的分化,抑制Th2细胞、Th17细胞、调节性T细胞(Treg)的分化,现在发现对某些T细胞亚群具有相反的效应,比如Treg。IL-27在不同的自身免疫性疾病中表现出促炎和抗炎的双重作用。作为最强大的抗原提呈细胞,树突状细胞(DC)和单核巨噬细胞是适应性免疫的启动者,引起免疫应答或耐受。IL-27对DC和单核巨噬细胞的作用并不一致,而这种差异很可能是由不同信号通路的比率、细胞因子微环境、疾病的发展阶段引起的。阐明IL-27对DC和单核巨噬细胞的影响或许可以及早地阻断异常免疫反应,对自身免疫性疾病的治疗提供新的途径。

EBV-miR-BART6-3p调控STMN1表达对鼻咽癌细胞凋亡及放射敏感性的影响

目的探讨EB病毒(EBV)-微小RNA(miR)-BART6-3p调控STMN1表达对鼻咽癌HNE2细胞凋亡和放射敏感性的影响。方法将体外培养的HNE2细胞分为对照组(未处理)、miR-NC组(转染阴性对照)、miR-BART6-3p组(转染miR-BART6-3p模拟物)、miR-BART6-3p+pcDNA组(共转染miR-BART6-3p模拟物和pcDNA3.4空载体质粒)和miR-BART6-3p+STMN1组(共转染miR-BART6-3p模拟物和pcDNA3.4-STMN1过表达质粒);采用实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)检测HNE2细胞中miR-BART6-3p和STMN1 mRNA表达;流式细胞仪检测HNE2细胞凋亡情况;克隆形成实验检测不同剂量X射线照射后HNE2细胞生存情况;Western印迹检测HNE2细胞中STMN1蛋白表达。结果miR-BART6-3p组细胞中miR-BART6-3p表达水平和细胞凋亡率显著高于miR-NC组,而细胞存活分数及STMN1表达水平均显著低于miR-NC组(P<0.05);miR-BART6-3p+STMN1组细胞中细胞凋亡率显著低于miR-BART6-3p+pcDNA组,而STMN1表达水平以及细胞存活分数显著高于miR-BART6-3p+pcDNA组(P<0.05)。结论miR-BART6-3p可通过下调STMN1表达诱导鼻咽癌HNE2细胞凋亡并增强细胞放射敏感性。

用EB3D求解旋转体拉深件的毛坯直径

形状复杂的旋转体拉深件(不变簿拉深),采用“久里金”法则计算其毛坯直径,既麻烦、精度又不高。但利用CAXA三维电子图板(以下简称“EB3D”)强大的“三维造型”和“查询”功能,并集成其内部二维电子图板(以下简称“EB”)

基于参数化特征造型系统的草图尺寸标注的实现

论述了在参数化特征造型系统中草图元素间的尺寸关系 ,并将其细分为六类 .然后阐述了表示各种类型尺寸标注的诸要素的方法以及尺寸标注的过程 .最后讲述了草图尺寸标注在参数化特征造型系统 EB3D中的实现 .

狂犬病病毒固定株感染对微管结合蛋白EB3表达的影响

为研究末端结合蛋白RP/EB家族成员3(EB3)在狂犬病病毒(RABV)感染引起大鼠神经元细胞骨架发生明显改变过程中的变化情况,本研究采用RABV固定株CVS感染大鼠原代神经元细胞,从转录及翻译水平分别对EB3进行检测,并通过免疫荧光观察EB3在神经元细胞内的分布变化。结果显示,病毒感染6 h后,EB3转录和翻译水平有明显下调,EB3分布呈突起向胞体集中趋势,表明病毒可能通过对微管结合蛋白EB3的下调,使细胞骨架的稳定性降低。本实验结果为进一步研究RABV引起的神经元退行性病变机制奠定了基础。

EB病毒诱导基因3蛋白的生物学效应

EB病毒诱导基因3(epstein-barr virus-induced gene3,EBI3)是一种在EB病毒感染的B淋巴细胞中发现并命名的红细胞生成素受体样糖蛋白。它参与组成细胞因子IL-27和IL-35,在T细胞的增殖,Th1、Th2和Th17细胞以及NK细胞诱导分化过程中具有重要的免疫调节效应。同时EBI3作为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞中Foxp3转录因子的下游靶位,可以促进调节性T细胞的增殖,并对效应性T细胞具有抑制功能。EBI3这些重要的免疫活性在自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤以及变应性疾病等临床多种疾病的发生、发展中均具有重要的生物学效应。

Eu(Ⅲ)(EB)_3配合物与DNA的相互作用模式研究

应用荧光光谱法得Eu(Ⅲ)(EB)3配合物与DNA可形成摩尔比为41的复合物,通过磷酸盐实验与阴离子猝灭剂实验可知其相互作用为混合模式,包括嵌插作用、沟渠作用和静电作用。由双倒数法求得ΔrHmΘ=1.11×105 J/mol,ΔrGmΘ28℃=-3.24×104 J/mol,ΔrSmΘ28℃=475.08 J/(mol.K),可知该反应为熵驱动反应。

新型免疫抑制因子白细胞介素35与自身免疫性疾病

白细胞介素35(IL-35)是最近发现的新型免疫抑制/抗炎因子,是IL-12家族成员之一,它是由IL-12α、Ebi3两个亚基组成的二聚体蛋白,主要由调节性T细胞(Treg)组成性分泌,它对于Treg细胞功效的发挥是必需的,IL-35通过诱导调节性T细胞扩增、抑制效应细胞如Th17细胞增殖,明显抑制实验性结肠炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎等自身免疫疾病症状。本文阐述了IL-35作用机制及其在自身免疫性疾病中的调控机制,为寻找新的治疗靶点提供新思路。

OSCC和OLK患者口腔黏膜组织中IL-12p35和Ebi3的表达及意义

目的探讨口腔鳞状细胞癌(OSCC)和口腔白斑(OLK)患者口腔黏膜组织中白细胞介素35(IL-35)α链p35亚基(IL-12p35)和β链EB病毒诱导基因3亚基(Ebi3)的表达及意义。方法选取OSCC患者34例、OLK患者32例及正颌手术、良性非炎症性肿瘤切除术患者15例分别作为OSCC组、OLK组及正常组,取3组患者口腔黏膜组织,采用苏木精-伊红染色法(HE)染色进行形态学观察和病理学诊断,采用免疫组织化学超敏二步法(IHC)检测IL-12p35和Ebi3蛋白的表达。结果OSCC、OLK组患者口腔黏膜组织Ebi3、IL-12p35蛋白阳性表达率均高于正常组(P<0.001),且OSCC与OLK组间Ebi3蛋白的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.001);IL-12p35、Ebi3蛋白阳性表达分别与上皮异常增生程度呈正相关关系(r IL-12p35=0.370,P=0.001;r Ebi3=0.380,P<0.001);OSCC组中Ebi3、IL-12p35蛋白表达与患者淋巴结转移有关(P<0.05),但与其性别、年龄、分化程度及TNM分期无关(P>0.05)。结论IL-12p35和Ebi3在OSCC及OLK患者口腔黏膜组织中表达上调,IL-35可能在口腔黏膜癌变发展过程中起重要作用。

重组免疫毒素EBI3-Luffin P1原核表达质粒的构建、表达及其生物学活性

目的构建重组免疫毒素EBI3-Luffin P1的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达,纯化后初步检测其生物学活性。方法从质粒pET-32a-EBI3中扩增EBI3基因,与合成的Luffin P1基因连接,克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a-EBI3-Luffin P1,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组EBI3-Luffin P1蛋白经亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性,体外试验初步鉴定其生物学活性。结果重组质粒pET-32a-EBI3-Luffin P1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组EBI3-Luffin P1蛋白相对分子质量约为50 000,主要以包涵体形式存在,诱导8 h表达量可达菌体总蛋白的44%;纯化的重组蛋白纯度约为98%,可与EBI3蛋白免疫小鼠血清发生特异性反应,并可显著抑制小鼠脾脏细胞分泌IFNγ。结论成功构建了重组免疫毒素EBI3-Luffin P1的原核表达质粒,表达并纯化了重组蛋白,为进一步研究其在缓解、治疗免疫性疾病及红白血病中的作用奠定了基础。

灯盏花Eb14-3-3基因的克隆及表达分析

为探究灯盏花Eb14-3-3基因表达特征,本研究从灯盏花基因组数据库中克隆了拟南芥同源基因灯盏花14-3-3υ序列信息,利用生物信息学方法对该蛋白的功能和活性位点进行预测,通过荧光定量PCR分析在非生物胁迫条件下该基因的表达变化。结果表明,Eb14-3-3的ORF序列长804 bp,编码267个氨基酸;该蛋白的分子量和理论等电点分别为65296 k D和5.16。Eb14-3-3蛋白序列中富含磷酸化位点,为一个非分泌型蛋白,并且在其结构中无跨膜结构域。二级结构分析显示有156个α-螺旋,47个片层延伸,9个β转角,55个无规则卷曲,属于14-3-3蛋白家族成员。RT-qPCR表达模式分析表明,5%PEG处理后,灯盏花叶、花和茎中Eb14-3-3基因的表达量在24 h明显上升,但在处理48 h后,Eb14-3-3的表达量大幅度下降;Eb14-3-3基因在灯盏花根部的表达量,在5%PEG处理10 h后,其表达量显著上升,并在处理后48 h呈现显著下降趋势。本研究将为培育新的灯盏花抗逆种质资源提供研究理论基础。

佛手柑内酯抑制EBI3/STAT3信号增强结肠癌细胞对5-Fu化疗敏感性的研究

目的探究佛手柑内酯(Bg)对结肠癌细胞5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药性的影响及其机制。方法采用Bg作用人结肠癌SW1116/5-Fu和LoVo/5-Fu耐药细胞系;CCK-8法检测细胞增殖能力;Western blot检测Bcl-2、Bax、EB病毒诱导基因3(EBI3)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、CYP1B1和MEKK2蛋白质表达。结果Bg作用SW1116、SW1116/5-Fu、LoVo和LoVo/5-Fu细胞后,5-Fu作用细胞的半抑制浓度(IC50)值明显降低(P<0.05),尤其是Bg联合EBI3阻断剂作用细胞后,IC50值明显下降(P<0.05)。Western blot检测结果显示,Bg作用下SW1116/5-Fu和LoVo/5-Fu细胞Bcl-2、EBI3、STAT3、p-STAT3、CYP1B1和MEKK2蛋白质表达水平均明显降低,Bax蛋白质表达水平明显升高。结论Bg可能通过诱导细胞凋亡、抑制EBI3/STAT3信号通路及抑制耐药相关蛋白质CYP1B1和MEKK2表达增强结肠癌细胞对5-Fu的化疗敏感性。

EB病毒诱导基因3增强结肠癌5-氟尿嘧啶耐药株耐药性的研究

目的建立结肠癌(CRC)5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药株探讨EB病毒诱导基因3(EBI3)与CRC 5-Fu耐药的关系。方法采用5-Fu持续接触浓度递增诱导法建立人CRC耐药细胞系;CCK-8法检测细胞增殖和耐药性;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核形态学改变;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡;EBI3 CRISPR激活质粒和EBI3 CRISPR/Cas9敲除质粒转染结肠癌耐药和非耐药细胞后,Western blot检测EBI3、细胞色素P450家族成员1B1(CYP1B1)和有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(MEKK2)表达。结果采用5-Fu持续接触浓度递增诱导法建立人结肠CRC细胞系SW1116/5-Fu和LoVo/5-Fu;细胞周期检测结果显示,与SW1116和LoVo细胞相比,SW1116和SW1116/5-Fu细胞周期各期百分比无明显差异(P>0.05)。与LoVo细胞相比,LoVo/5-Fu细胞G1期细胞百分比明显增高(P<0.05),S期细胞百分比明显降低(P<0.05);Western blot检测结果显示,与SW1116和LoVo细胞相比,SW1116/5-Fu和LoVo/5-Fu细胞EBI3、CYP1B1和MEKK2表达均明显增高;SW1116、SW1116/5-Fu、LoVo和LoVo/5-Fu细胞转染EBI3敲除质粒后,5-Fu作用细胞的半抑制浓度(IC50)值明显降低(P<0.05),而细胞转染EBI3激活质粒后,5-Fu作用细胞的IC50值明显增高(P<0.05)。结论EBI3可能介导了CRC细胞对5-Fu的耐药过程。