用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株

目的构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株。方法从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法筛选FABZ缺陷株,蛋白质印迹(Western blotting)检测虫体内附加表位标签Ty的表达。在5×105个FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素(终浓度为1μg/ml),Western blotting检测带有Ty标签的FABZ表达情况。结果筛选获得的缺陷株可表达带有Ty标签的转运肽型FABZ和成熟型FABZ。FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素24 h和48 h后,转运肽型FABZ表达量均较对照组显著降低(P<0.05)。结论构建了由脱水四环素调控表达的弓形虫FABZ缺陷株。

小鼠H1foo基因四环素诱导表达系统的构建与表达

卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研究H1foo的功能,本试验通过采用四环素诱导表达载体系统,用PCR的方法扩增了小鼠的H1foo基因和四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子区。用双酶切和连接等方法将上述元件连接到真核表达载体pVenus上,构建了重组质粒pVenus-tet-CMV-H1foo。双酶切和测序结果显示,片段连接正确,且全长测序正确。本试验所构建的四环素诱导的小鼠H1foo真核表达系统有助于人们在体细胞中更好地探讨H1foo在特定时间的作用和功能。

四环素调控表达系统调节EGFP和HBV前核心蛋白在哺乳动物细胞中表达

构建新型四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,利用脂质体转染哺乳动物细胞,流式细胞术检测结果说明:应用此系统四环素可使EGFP在CHO细胞中的表达提高18倍,在SSMC-7721细胞与HEK293细胞中的表达分别提高5倍和接近2倍,并且,四环素可有效地诱导HBV的前核心蛋白基因在肝癌细胞系中的表达。

四环素调控的真核表达体系Hep3B Tet-On细胞株的建立

目的 建立可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体系Hep3BTet On细胞株 ,用于基因功能的研究。方法 将pTet On质粒用脂质体介导法转染Hep3B细胞 ,经G4 18筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆分别扩增后 ,瞬时转染pTRE luc(编码荧光素酶蛋白 )质粒 ,Dox诱导表达后 ,检测荧光素酶活性 ,逐一筛选四环素调控高表达外源基因的Hep3BTet On细胞株。结果 成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的Hep3BTet On细胞株。结论 Hep3BTet On细胞株可用于外源基因的真核调控高表达 ,为研究真核基因功能提供了一种有力的实验手段。

诱导型eIF3g人工microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRevTRE2-eIF3g-microRNA。将四环素调控表达系统的Tet-off质粒转染K562细胞获得稳定转染克隆后,再利用带有报告基因GFP的pRevTRE2-GFP转染选择调控能力较好的K562/Tet-off细胞株,将pRevTRE2-eIF3g-microRNA转染K562/Tet-off细胞,Westernblot检测eIF3g的表达,以研究eIF3g人工microRNA的作用效果。结果:DNA测序结果显示,针对人eIF3g的人工microRNA的克隆正确。pRevTRE2-GFP转染结果表明所选择的K562/Tet-off细胞株有较好的诱导功能。Westernblot结果显示,转染pRevTRE2-eIF3g-microRNA的K562/Tet-off细胞可用四环素调控eIF3g人工microRNA的表达从而抑制K562细胞中eIF3g的表达。结论:成功构建了可用四环素调控的eIF3g人工mi-croRNA表达载体,能有效调控K562细胞中eIF3g的表达。

可诱导的shRNAs表达系统对HeLa细胞SMYD3基因表达的抑制

目的:探讨可诱导的shRNAs表达载体介导的RNA干扰技术对HeLa细胞SMYD3基因的抑制作用。方法:设计和构建由强力霉素调控产生针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒,转染至HeLa细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,RT-PCR检测SMYD3基因的表达,MTT法检测对细胞增殖的影响。结果:酶切鉴定、测序分析证实shRNAs表达质粒构建成功。转染HeLa细胞后,在强力霉素诱导下,受到特异SMYD3 shRNAs干扰的HeLa细胞发生了典型的凋亡形态学改变。同时SMYD3 mRNA表达下调,细胞生长受抑制。而阴性对照组和空白对照组无明显变化。结论:针对SMYD3基因的可诱导的shRNAs表达质粒转染HeLa细胞后,在强力霉素的作用下,可阻断SMYD3基因的表达,抑制HeLa细胞的增殖,并能诱导HeLa细胞凋亡。

基于四环素诱导型Hnf1β和Foxa3表达载体的小鼠胚胎成纤维细胞转分化为肝干细胞的实验体系研究

目的:建立基于四环素诱导型Hnf1β和Foxa3表达载体的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)转分化为肝干细胞(iHepSCs-Dox)的诱导实验体系,为后续转分化过程所涉及的分子机制研究提供有效工具。方法:构建TetO-Hnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry四环素诱导型慢病毒载体,经慢病毒介导将其转染入293FT细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同浓度的多西环素(Dox)诱导外源基因表达水平的差异,确定最佳Dox诱导浓度;将两个诱导型表达载体转染到MEF细胞中,参照先前建立的诱导体系,在合适的Dox浓度下启动Hnf1β和Foxa3基因的表达,诱导MEF细胞的转分化。对经过20 d诱导出现的上皮样细胞集落进行扩增,获得iHepSCs-Dox细胞系。利用CCK-8法、克隆形成实验、碱性磷酸酶染色、体外诱导分化以及反转录PCR(RT-PCR)等实验,对所获得的iHepSCs-Dox细胞系的生物学特性作鉴定,同时与前期获得的诱导型肝干细胞系(iHepSCs)作对比,以此对基于四环素诱导型表达载体的转分化体系的诱导效果进行评价。结果:qPCR结果显示,在培养基中添加100 ng/mL的Dox作用24 h即可启动外源基因表达,撤去Dox 48 h后,外源基因的表达显著降低甚至关闭;RT-PCR结果显示,iHepSCs-Dox细胞表达胆管细胞的标志(CK19)、肝胆共同标志(CK18)以及肝脏干/前体细胞标志(Dlk1、Sox9、EpCAM),碱性磷酸酶染色结果显示阳性;具有形成克隆的能力;能够在体外诱导分化为肝干细胞,以上干性特征与前期构建的iHepSCs具有较大相似性。当从培养基中撤掉Dox之后,随着双因子表达的停止,iHepSCs-Dox细胞的增殖速率明显下降,CK18、EpCAM的表达下调;失去克隆形成能力,在体外无法诱导其分化为肝细胞。结论:成功建立了基于四环素诱导型双转录因子表达载体的MEF细胞转分化为肝干细胞的诱导体系,该诱导体系可以作为后续研究转分化过程中所涉及的分子机制的有效工具。另外,结果提示外源基因的持续表达是iHepSCs-Dox细胞干性维持的必要条件。

四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcD-NA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R真核表达载体,并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。

在四环素调控系统下表达HA蛋白MDCK细胞系的建立

细胞培养流感病毒生产疫苗过程中细胞系的选择至关重要,本研究建立了可控表达H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白的MDCK细胞系,能有效支持H9N2流感病毒的扩增。本研究应用插入四环素调控元件和H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组质粒V2-H9,与辅助质粒pMDSV、psPAX2共转染293T细胞包装慢病毒,将包装出的慢病毒感染MDCK细胞,通过添加嘌呤霉素筛选出阳性的单克隆细胞。再用PR8 SH441病毒感染筛选出来的MDCK单克隆细胞。结果显示,流感病毒在其中4株MDCK单克隆细胞的HA效价接近于8;生长曲线结果显示,流感病毒在第34株MDCK单克隆细胞中复制效果最好;间接免疫荧光(IFA)和Western blot检验结果显示,第34株MDCK单克隆细胞H9 HA的表达量最高;将第34株MDCK单克隆细胞驯化后进行悬浮培养,每隔24 h测定细胞密度,结果表明,第34株MDCK单克隆细胞可以悬浮培养,且流感病毒在第34株MDCK悬浮细胞中HA效价可达9log2。以上结果表明,本研究获得了一株可高效扩增H9亚型禽流感病毒的MDCK细胞株,为流感弱毒疫苗的研发提供了新的研究方法和实验基础。

四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响

目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DOX诱导的YAP1敲减的胃癌细胞系;RT-PCR检测YAP1 mRNA相对表达量,Western blotting检测YAP1蛋白水平变化;平板克隆实验检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的情况。结果构建四环素诱导的YAP1敲减的病毒质粒,酶切鉴定结果显示,在6000 bp和3000 bp处各有一条带,测序结果与设计的shRNA序列一致。包装慢病毒并感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,DOX诱导组中,感染pLKO.1-tetON-YAP1的病毒的细胞中YAP1 mRNA的相对表达量和蛋白水平明显下调;而未诱导组则无明显变化。平板克隆形成实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组克隆形成数明显降低;未诱导组无明显变化。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组表达后细胞迁移能力受到抑制,未诱导组无明显变化。结论成功建立了四环素诱导的慢病毒系统,利用此系统敲减胃癌细胞YAP1基因,胃癌细胞增殖和迁移能力受到抑制。

联通成功开发3G停车诱导系统

杭州联通携手杭州市城管办联合研发的“杭州市3G道路停车诱导系统”日前正式上线。有了它，城市道路停车难问题就可迎刃而解了。

单质粒模式诱导表达载体系统的建立

在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 8 9倍。

沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响

背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论:(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);(4)结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础,也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。

β-神经生长因子的诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用

目的运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统探讨β-神经生长因子(β-NGF)在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况及其对角膜缘干细胞(LSCs)的作用。方法将p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT细胞进行扩增,收获慢病毒,再共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导β-NGF表达(分为未转染组、1000、100和1000μg/L Dox诱导表达组)。48 h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。体外分离培养LSCs,慢病毒共转染LSCs,分为对照组(未转染组)和诱导表达组[实验组A(慢病毒载体Dox 1000μg/L)、实验组B(慢病毒载体Dox 100μg/L)、实验组C(慢病毒空载体Dox 1000μg/L)],诱导表达48 h后细胞免疫荧光染色检测NGF及相关蛋白(p63、p38、Trk A)的表达情况。结果NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组及实验组C相比,实验组A的p63表达降低,Trk A表达降低,p38表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组及实验组C相比,实验组B的p63表达增加,Trk A表达增加,p38表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达不同剂量β-NGF蛋白,低剂量Dox诱导下NGF产生的微环境可促进LSCs的体外扩增,并能维持LSCs的干细胞特性。

Tet-on系统诱导猿猴病毒40T在CHO细胞中的表达

四环素诱导表达系统(T et-off/T et-on系统)是比较成熟的真核生物基因诱导表达系统之一,具有高效、无毒、严密开/关功能的特点。猿猴病毒40T(SV 40T)是一种病毒癌蛋白,其与肿瘤抑制蛋白p53和R b结合,并使之失活,从而消除它们抑制细胞生长的功能,使细胞分裂加速,形成肿瘤。利用T et-on系统首先稳定筛选获得了表达T et-on系统调节元件rtTA的阳性细胞CHO-pT et-on,再通过稳定筛选又成功得到导入其反应元件的双阳性细胞CHO-pT et-on-pTRE 2-SV 40T-Hyg,经强力霉素诱导表达了目的基因SV 40T,建立了T et-on基因诱导表达系统的细胞诱导表达研究平台。

Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究

目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。

建立可诱导表达TNFAIP1的稳定细胞系

利用Tet-Off可诱导表达系统在HT1080细胞中建立可诱导表达TNFAIP1基因的稳定细胞系.首先将融合表达GFP的TNFAIP1片段克隆到反应质粒pTRE2hyg中,然后将该质粒转染到HT1080/Tet-off细胞中,使用潮霉素B筛选,挑取单克隆,得到稳定转染的细胞系,扩大培养后在荧光显微镜下观察克隆的诱导效率,得到了低背景,高效诱导表达GFP-TNFAIP1的稳定细胞系,便于研究TNFAIP1在细胞生长、细胞周期和细胞信号通路等方面的作用.

家蚕类ω3-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达及功能研究

ω3-脂肪酸脱氢酶是生物体内催化多不饱和脂肪酸合成的关键酶之一,其表达受生物胁迫和非生物胁迫因素的影响。从家蚕蛹中克隆了类ω3-脂肪酸脱氢酶基因(Bm FAD3-like),该基因具有一个长度为1 083 bp的开放阅读框,编码由360个氨基酸残基组成的分子质量为41.5 k D的蛋白质。将该基因克隆到p YES2.0载体,构建重组表达载体p YBm FAD3-like及重组酿酒酵母工程菌株YBm FAD3-like后进行诱导表达,收集菌体提取脂肪酸,经气相色谱检测表明异源表达的重组Bm FAD3-like能够将诱导表达体系中加入的外源底物亚油酸(LA)转化为α-亚麻酸(ALA)。半定量RT-PCR检测Bm FAD3-like基因mRNA几乎在家蚕5龄第3天幼虫的所有组织中都有转录,在5龄幼虫期、蛹期和蛾期的转录水平较高,并且其转录水平受低温(0℃)和真菌(球孢白僵菌Beauveria bassiana)侵染(6~36 h)诱导显著上调。对家蚕蛹体注射siRNA沉默目的基因12~72 h后,Bm FAD3-like mRNA转录水平显著下调。研究结果表明,Bm FAD3-like的表达产物能催化LA在ω3位脱氢生成ALA,并且该基因在蚕体受到低温诱导和真菌侵染等胁迫时显著上调表达,外源siRNA能够介导该基因的沉默,显著下调其转录水平。

tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究

【目的】构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型。【方法】通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆。【结果】带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192︰21),其中克隆9的诱导倍数最高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株。【结论】荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性。

基于3G移动电子商务平台的宁波市停车管理策略

本文针对目前我国城市道路"停车难"现状,对城市道路停车管理问题进行了分析,基于3G移动通信网络和移动电子商务技术,对宁波市城市道路停车管理和未来城市停车管理的发展方向等问题进行了研究,提出了一种以停车诱导信息管理为核心、基于3G移动电子商务平台的城市停车管理策略和方案,并结合宁波市实际情况提出相应的停车管理改进措施,改变了传统的以人工管理为主、以停车设施和停车者为管理对象的停车管理方式。