铜绿假单胞菌的信号分子3-oxo-C12-HSL促进小鼠MH-S肺泡巨噬细胞自噬

目的探讨3-oxo-C12-HSL对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞自噬的影响。方法用Las I基因(3-oxo-C12-HSL合成基因)缺失型和野生型的铜绿假单胞菌(PA)菌株的培养物上清液以及化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子处理MH-S细胞,激光共聚焦荧光显微镜观察LC3-GFP荧光斑点以及Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值来监测自噬的形成,同时检测p62的降解以及氯喹对LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影响来监测自噬流(autophagic flux)的变化。结果野生型PA菌株的培养物上清液使MH-S细胞LC3-GFP荧光斑点增多(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.01),LasⅠ基因缺失型PA菌株不能引起上述自噬相关指标的改变。化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子能够明显增加自噬体数量,上调LC3Ⅱ的表达(P<0.01);自噬底物p62随着3-oxo-C12-HSL作用时间的延长而进行性降解,溶酶体抑制剂氯喹可增强3-oxoC12-HSL引起的LC3Ⅱ累积(P<0.05,P<0.01)。结论 3-oxo-C12-HSL可增加MH-S细胞的自噬水平。

3-O-C12-HSL通过阻碍人树突状细胞成熟介导Th细胞极性分化

目的探讨铜绿假单胞菌分泌的信号分子3-O-C12-HSL对脂多糖诱导的人外周血单核细胞来源树突状细胞（Mo．DCs）成熟及n细胞极化的干预作用。方法采用免疫磁珠法分选人外周血CDl4＋单核细胞，经重组人粒一单核细胞集落刺激因子和重组人IL-4诱导其分化为Mo-DCs。CCK-8法检测3-0．CIrHSL对Mo．DCs活性影响；流式细胞术检测3-O-C12-HSL对Mo-DCs表型（CDlle-,CD40、CD80、HIJA．DR）的影响；ELISA检测Mo—DCs培养上清IFN-1和IL-12浓度；混合淋巴细胞反应观察3-O．C旷HSL对Th细胞增殖和细胞因子分泌的影响。结果3-O-C12-HSL终浓度200μmol／L时可影响Mo-DCs活性。与脂多糖对照组比较，终浓度50μmoL／L和100μmoL／L的3-O-C12-HSL明显下调脂多糖诱导的Mo-DCs表面分子CD40、CD80和HLA-DR分子表达水平，抑制Mo·DCs分泌IL-12，促进Mo．DCs分泌IL-10，抑制Th细胞增殖和IFN-γIL-12分泌，促进n细胞分泌IL-10。结论3-O-C12-HSL可抑制脂多糖诱导的Mo-DCs成熟，诱导Th2细胞极性分化，影响机体免疫系统对铜绿假单胞菌的清除作用。

铜绿假单胞菌pvdQ基因在肠道上皮细胞Caco-2中的表达及其功能研究

目的探讨铜绿假单胞菌pvdQ基因阻止密度感应系统自体诱导因子3O-oxo-C12-HSL干扰肠道上皮细胞Caco-2的作用。方法构建带有FLAG标签的pvdQ基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-pvdQ并鉴定,将带有pvdQ基因的质粒转染入Caco-2细胞,并用Western blot法检测pvdQ基因在Caco-2细胞中的表达。3O-oxo-C12-HSL干扰转染前后的Caco-2细胞,利用质谱分析仪检测Caco-2细胞上清中3O-oxo-C12-HSL浓度变化。结果经酶切鉴定pvdQ基因真核表达载体构建成功,Western blot检测结果显示pvdQ基因能在人肠道上皮细胞Caco-2中表达。质谱分析结果显示,转染pvdQ基因后,Caco-2细胞上清中3O-oxo-C12-HSL浓度明显减少(P<0.05)。结论 pvdQ基因成功在人肠道上皮细胞Caco-2中表达,并降解细胞周围3O-oxo-C12-HSL分子,为进一步研究pvdQ基因对Caco-2细胞的保护作用奠定基础。

pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能

目的拟研究长链高丝氨酸内酯降解基因pvdQ在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。方法通过乙酸锂转化法构建CAI-4HWP1-LacZ菌株,使用X-gal平板显色法检测3-oxo-C12-HSL对白假丝酵母菌形态转换的影响;观察与铜绿假单胞菌pvdQ高表达株、野生株PAO1共同培养时,白假丝酵母菌的形态变化,了解pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。结果 400μg 3-oxo-C12-HSL即可完全抑制白假丝酵母菌的形态转换。铜绿假单胞菌pvdQ高表达株和野生株PAO1均可抑制白假丝酵母菌菌丝形成。pvdQ高表达株对白假丝酵母菌的形态抑制作用较野生株PAO1减弱。结论铜绿假单胞菌通过分泌信号分子3-oxo-C12-HSL,可抑制白假丝酵母菌形态转换。随着pvdQ表达增加,铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌的形态抑制作用减弱,即pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中起负性调节作用。其作用机制可能与pvdQ基因对3-oxo-C12-HSL的水解作用有关。