miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景:目前多项研究证实了丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与了细胞的增殖过程,且miRNA参与增生性瘢痕的发生发展,因此深入探讨了miR-27a-3p和丝裂原活化蛋白激酶信号通路在病理性瘢痕形成中的作用。目的:探究miR-27a-3p通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:收集皮肤标本并分别分离出原代成纤维细胞,倒置显微镜观察原代细胞,免疫荧光予以验证;采用qRT-PCR检测miR-27a-3p在组织中的相对表达水平;利用数据库预测miR-27a-3p的靶基因,再将预测的靶基因进行基因本体功能富集分析及京都基因与基因组百科全书生物通路富集分析;设置分组为:空白对照组、阴性对照组、miR-27a-3p过表达组、miR-27a-3p抑制组、miR-27a-3p过表达+p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+细胞外信号调节蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+c-Jun氨基末端激酶抑制剂组,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38激酶总量及其磷酸化水平,采用CCK-8法和EdU检测细胞增殖情况。结果与结论:①与正常皮肤成纤维细胞相比,增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性更强(P<0.05),增殖速度也更快(P<0.001);②与正常皮肤相比,miR-27a-3p在增生性瘢痕中呈高表达(P<0.001);③与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p能促进细胞的增殖活性(P<0.001)和增殖水平(P<0.001);④与阴性对照组相比,敲低miR-27a-3p能抑制细胞的增殖活性(P<0.05)和增殖水平(P<0.001);⑤与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p促进细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);与阴性对照组相比,敲减miR-27a-3p能抑制细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);⑥与miR-27a-3p过表达组相比,细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的特异性抑制剂可逆转miR-27a-3p对成纤维细胞的增殖活性(P<0.01)和增殖水平(P<0.001);⑦提示miR-27a-3p通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。

静态磁场通过激活FGFR1/JAK2/STAT3信号通路促进皮肤成纤维细胞的增殖活性和迁移表型

目的:通过体外实验探讨静态磁场(SMF)对皮肤成纤维细胞增殖活性和迁移表型的调控作用与潜在机制。方法:将人皮肤成纤维细胞(HSFs)分为5组,包括对照组、SMF组、SMF+阿魏酸组、SMF+芦可替尼组、SMF+Stattic组。对照组为正常培养的HSFs;SMF组的HSFs细胞暴露于1mT的SMF中。其余三组分别将FGFR1、JAK2、STAT3的抑制剂(3μmoL/L阿魏酸、3nmoL/L芦可替尼、20μmoL/L的Stattic)与HSFs一起预培养,并暴露于1mT的SMF中,所有组均处理24h。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)分析细胞的增殖活性。用ELISA试剂盒法检测人类B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(BAX)的水平。用Western blot检测凋亡标志蛋白cleaved-caspase3及FGFR1、JAK2、STAT3、磷酸化的(p)-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3的表达以及细胞迁移相关表型高迁移率组蛋白1(HMGB1)、波形蛋白(vimentin)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2的表达。结果:与对照组比,SMF组的细胞增殖活性增加,BAX的水平减少,cleaved-caspase3的蛋白表达水平下调,p-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著上调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+阿魏酸组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,而p-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达均显著下调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+芦可替尼组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,JAK2、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著下调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+Stattic组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,STAT3、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著下调(均P<0.05)。结论:SMF通过激活FGFR1/JAK2/STAT3信号通路促进皮肤成纤维细胞的增殖活性和迁移表型。

过表达sFRP3对小鼠原代心肌成纤维细胞活化增殖的影响

目的探讨Wnt信号通路调控剂分泌型卷曲相关蛋白3(sFRP3)在小鼠心肌成纤维细胞(CFs)活化增殖中的作用。方法购入1~3 d的小鼠乳鼠,行手术对心脏取材,消化后分离CFs进行培养。细胞贴壁生长后使用转化生长因子(TGF-β1)刺激构建CFs活化增殖模型;确认模型构建成功后分别向实验组和对照组细胞转染sFRP3过表达质粒和空载质粒24~48 h。通过Western blot、qRT-PCR的方法在分子层面对sFRP3、Periostin(POSTN)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达进行检测;使用MTT法、CCK-8法和EdU染色法检测细胞增殖能力的改变。结果在TGF-β1刺激构建的CFs活化增殖模型中,相较于对照组,模型组sFRP3蛋白及mRNA表达下降,活化增殖相关蛋白PCNA、POSTN和CollagenⅠ表达上调。另外,在质粒转染sFRP3过表达组的CFs中,PCNA、POSTN和CollagenⅠ蛋白及mRNA表达相较于空载组下降。MTT、CCK-8与EdU实验表明,质粒转染sFRP3过表达组的CFs增殖活性较空载组明显下降。结论过表达sFRP3明显抑制CFs活化增殖,提示sFRP3可能是参与调控CFs活化增殖的关键基因。

红景天苷促进MC3T3-E1细胞成骨分化能力的体外实验

背景:骨缺损可直接影响牙齿种植的成功率及种植体的长期稳定性。研究显示红景天苷可促进成骨细胞增殖、分化,但对于其成骨分化相关通路具体研究不多。目的:体外细胞实验研究红景天苷对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响,并探究其对相关基因和蛋白表达的影响。方法:采用CCK-8实验和碱性磷酸酶实验筛选红景天苷(0.5,1,5,10,50μmol/L)促进MC3T3-E1细胞增殖和分化的最佳浓度。实验分为4组:对照组、红景天苷组、红景天苷+LY294002组、LY294002组,分别用成骨诱导液、含10μmol/L红景天苷、10μmol/L红景天苷+10μmol/L LY294002、10μmol/L LY294002的成骨诱导液进行培养,观察红景天苷及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对成骨相关基因和蛋白表达的影响。结果与结论:①CCK-8实验和碱性磷酸酶实验显示:红景天苷促进MC3T3-E1细胞增殖的作用在10μmol/L时最显著;②与对照组相比,红景天苷可以促进矿化、促进细胞黏附、减少细胞死亡,提高Runx-2、骨钙素、骨桥蛋白的mRNA表达(P<0.01),提高Runx-2和p-Akt蛋白表达(P<0.01);而添加PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002则可逆转以上结果;③结果表明,红景天苷能促进MC3T3-E1细胞矿化,并能促进成骨相关基因、蛋白的表达,这可能与PI3K/Akt信号通路的激活有关。

党参多糖通过PI3K/AKT信号通路抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和诱导细胞周期阻滞的实验研究

目的:探讨党参多糖对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞周期进程的影响及其分子机制。方法:四唑盐比色测定法[3-(4,5-Dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]检测党参多糖对细胞存活率的影响,筛选党参多糖加药浓度,采用平板克隆实验检测瘢痕疙瘩成纤维细胞的克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期比例和细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western blot)分析增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和丝苏氨酸蛋白激酶(protein kinase B,AKT)蛋白磷酸化水平。结果:当党参多糖浓度小于80μmol/L时对瘢痕疙瘩成纤维细胞无明显毒性作用,本实验选择浓度为10、20、40μmol/L的党参多糖作为后续实验加药标准浓度;与0μmol/L组相比,10、20和40μmol/L组瘢痕疙瘩成纤维细胞克隆形成能力降低,细胞周期阻滞于G_(0)/G_(1)期,PCNA、Cyclin D1、CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达下调,细胞凋亡率升高,PI3K和AKT磷酸化水平降低(P<0.05)。结论:党参多糖能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞周期进程,其分子机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的激活有关。

黄芪甲苷可缓解MC3T3-E1细胞氧化应激损伤并促进成骨

背景:氧化应激是导致骨质疏松症的主要原因之一,减少氧化应激水平与增加抗氧化防御是治疗骨质疏松症的重要研究方向。研究证实黄芪甲苷具有抗骨质疏松作用,但其作用机制尚不明确。目的:探讨黄芪甲苷对氧化应激条件下MC3T3-E1细胞成骨的作用。方法:将MC3T3-E1细胞分4组培养:对照组加入完全培养基,模型组加入含过氧化氢的完全培养基干预24 h后更换为完全培养基,黄芪甲苷组加入含过氧化氢、黄芪甲苷的完全培养基干预24 h后更换为含黄芪甲苷的完全培养基,抑制剂组加入含过氧化氢、黄芪甲苷、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)抑制剂的完全培养基干预24 h后更换为含黄芪甲苷、ERK抑制剂的完全培养基。过氧化氢干预48 h后,通过丙二醛含量检测黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞氧化应激的缓解作用;过氧化氢干预48 h后进行成骨诱导培养,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色验证MC3T3-E1细胞成骨及矿化能力,通过RT-qPCR检测成骨相关基因的表达,Western blot检测成骨相关蛋白及ERK/腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路蛋白的表达。结果与结论:(1)模型组细胞内碱性磷酸酶含量与矿化结节形成均少于对照组(P<0.05),黄芪甲苷组细胞内碱性磷酸酶含量与矿化结节形成均多于模型组(P<0.05)。(2)与对照组比较,模型组细胞内丙二醛含量增加(P<0.05),骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA与蛋白表达均降低(P<0.05),AMPK mRNA与p-AMPK蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,黄芪甲苷组细胞内丙二醛含量减少(P<0.05),骨钙素、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA与蛋白表达均升高(P<0.05),ERK1/2、AMPK mRNA表达升高(P<0.05),p-AMPK、p-ERK1/2蛋白表达均升高(P<0.05);ERK抑制剂可部分抑制黄芪甲苷的上述作用。(3)结果表明,黄芪甲苷可通过激活ERK/AMPK信号通路促进氧化应激条件下MC3T3-E1细胞的成骨分化。

托法替布通过JAK/STAT3通路抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化

目的:研究泛Janus激酶(Janus kinase,JAK)抑制剂托法替布(tofacitinib)对转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的作用及机制,为临床治疗结缔组织病相关的间质性肺疾病提供理论依据。方法:(1)体外培养人胚胎肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast 1,HFL-1),设立6个组,分别为DMSO空白对照组、TGF-β1诱导组、TGF-β1联合不同浓度托法替布(0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L)药物干预实验组。采用CCK-8法检测细胞活力,划痕愈合实验检测细胞迁移能力。(2)采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)、蛋白免疫印迹实验(Western blotting)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COL1)基因及蛋白的表达水平。应用RT-PCR和酶联免疫吸附试验检测各组白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的基因和细胞培养上清液中的蛋白水平。(3)在不同组的细胞培养基中加入DMSO载体对照,以1.0μmol/L和5.0μmol/L的托法替布预培养30 min,然后加入TGF-β1处理1 h、6 h和24 h。以Western blotting检测Smad2/3、信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的蛋白磷酸化水平。结果:(1)托法替布抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞活力及迁移能力。(2)与空白对照组相比,TGF-β1诱导组HFL-1的α-SMA、COL1A1和FN1基因表达显著上调(P<0.05)。5.0μmol/L托法替布干预组的α-SMA基因表达与TGF-β1诱导组相比显著下调(P<0.05)。0.5~5.0μmol/L托法替布各干预组与TGF-β1诱导组相比均可抑制FN1基因表达(P<0.05)。各干预组与TGF-β1诱导组相比,COL1A1基因的表达无明显变化。(3)Western blotting结果提示,TGF-β1诱导组细胞α-SMA、FN1蛋白水平较对照组显著增加(P<0.05),COL1A1表达未见明显差异。托法替布不同浓度干预组与TGF-β1诱导组相比,α-SMA蛋白表达均有下降,其中2.0μmol/L和5.0μmol/L干预组与诱导组间的差异有统计学意义(P<0.05)。托法替布不同浓度干预组的FN1蛋白水平均有下降,但与TGF-β1诱导组相比差异无统计学意义。各干预组的COL1A1蛋白表达与TGF-β1诱导组相比差异无统计学意义。(4)TGF-β1诱导48 h,HFL-1细胞中IL-6基因及培养上清液中IL-6的表达水平较对照组显著升高,各浓度托法替布干预组与TGF-β1诱导组相比均有所降低。TGF-β1诱导1 h、6 h和24 h,STAT3蛋白磷酸化水平增加,托法替布预刺激抑制了6 h时Smad2/3的磷酸化水平,在1 h、6 h和24 h时均抑制了STAT3的磷酸化水平。结论:托法替布能抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞向肌成纤维细胞方向转化,其机制可能是通过抑制Smad2/3经典通路以及抑制TGF-β1所诱导的STAT3磷酸化,从而对肺纤维化疾病进展发挥保护作用。

槲皮素通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制小鼠成纤维细胞焦亡

目的探究槲皮素通过NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)信号通路调控小鼠成纤维细胞(NIH-3T3)焦亡的影响及其机制。方法实验分为对照(Control)组、模型(Model)组、槲皮素(HPS)组、NLRP3特异性抑制剂(MCC950)组。CCK-8法检测槲皮素对NIH-3T3细胞活力的影响。光镜下观察细胞形态变化,ELISA检测白细胞介素(IL)-18、IL-1β含量,Western blotting和qRT-PCR检测NLRP3、活化半胱氨酸蛋白酶1(Cleaved caspase-1)、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平。TUNEL染色及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞焦亡情况。结果槲皮素作用于NIH-3T3细胞最佳干预浓度和时间分别是20μmol/L和24 h。与Control组相比,Model组细胞出现明显肿胀、破裂、细胞内容物流出,IL-18、IL-1β含量和NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平均明显升高(P<0.001,P<0.0001),TUNEL染色的阳性细胞数及LDH释放量增加(P<0.0001)。与Model组相比,HPS组和MCC950组细胞焦亡情况改善,IL-18、IL-1β含量和NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平显著降低(P<0.01,P<0.001),TUNEL染色阳性细胞数及LDH释放量明显减少(P<0.0001)。结论槲皮素可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制成纤维细胞焦亡,下调炎症因子释放从而发挥治疗作用。

湖北枫杨总黄酮通过调控PI3K/AKT信号通路抑制成纤维细胞样滑膜细胞的迁移和侵袭

目的:观察湖北枫杨总黄酮(PHSTF)对人类风湿成纤维细胞样滑膜细胞(MH7A细胞)迁移和侵袭的抑制作用并初步探讨其可能作用机制。方法:将MH7A细胞分为分为对照组(不做任何处理)、低剂量(6.25 mg/L)PHSTF组、中剂量(12.5 mg/L)PHSTF组、高剂量(25 mg/L)PHSTF组、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激动剂740Y-P(10μmol/L)组和740Y-P(10μmol/L)+高剂量(25 mg/L)PHSTF组。采用CCK-8法检测MH7A细胞活力;划痕实验和Transwell实验检测MH7A细胞的迁移和侵袭;Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平。结果:与对照组相比,各剂量PHSTF组MH7A细胞活力显著降低(P<0.05),划痕愈合面积显著减小(P<0.01),迁移和侵袭至下室的细胞显著减少(P<0.01),MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著降低(P<0.01)。与高剂量PHSTF组相比,PI3K激动剂740Y-P显著提高了PHSTF处理下MH7A细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01),也使得MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著升高(P<0.01)。结论:PHSTF能通过调控PI3K/AKT信号通路抑制MH7A细胞迁移和侵袭。

铁死亡诱导剂RAS合成致死分子3抑制病理性瘢痕成纤维细胞的纤维化

背景:病理性瘢痕主要表现为异常的细胞外基质积累和过度的成纤维细胞增殖,成纤维细胞过度增殖就会产生大量以胶原纤维为主的细胞外基质。因此深入探讨成纤维细胞纤维化在病理性瘢痕形成中的作用,将为揭示病理性瘢痕的机制和生物学治疗提供新思路。目的:探讨铁死亡诱导剂RAS合成致死分子3(RAS-selective lethal small molecule 3,RSL3)对人病理性瘢痕成纤维细胞纤维化的影响。方法:收集10例宁夏医科大学总医院烧伤整形美容科提供的病理性瘢痕组织和同一个体正常皮肤组织,提取人病理性瘢痕成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞用于后续实验;苏木精-伊红染色观察病理性瘢痕组织和正常皮肤组织的形态;倒置显微镜观察病理性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的外观形态;免疫荧光实验验证所提取的细胞是否为成纤维细胞;用不同浓度的RSL3(1,3,5,7,9,11,13μmol/L)干预细胞,CCK-8法检测RSL3作用于成纤维细胞的半数抑制浓度(IC_(50));设置对照组(不做处理)和RSL3干预组(用7μmol/L的RSL3干预细胞24 h),qRT-PCR和Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的mRNA和蛋白的表达;检测细胞丙二醛浓度;划痕试验检测细胞划痕后24 h剩余划痕面积,并计算剩余划痕面积百分比。结果与结论:①与正常皮肤组相比,病理性瘢痕组的谷胱甘肽过氧化物酶4高表达(mRNA:t=3.252,P<0.01;蛋白:t=5.075,P<0.01);②与正常皮肤成纤维细胞组相比,病理性瘢痕成纤维细胞组的谷胱甘肽过氧化物酶4高表达(mRNA:t=10.32,P<0.01;蛋白:t=26.22,P<0.01);③与对照组相比,RSL3干预组谷胱甘肽过氧化物酶4表达减少(mRNA:t=2.798,P<0.05;蛋白:t=4.643,P<0.01),丙二醛浓度上升(t=2.917,P<0.05),Ⅰ型胶原蛋白(mRNA:t=15.84,P<0.01;蛋白:t=4.610,P<0.01)、Ⅲ型胶原蛋白(mRNA:t=28.86,P<0.01;蛋白:t=7.713,P<0.01)和α-平滑肌肌动蛋白(mRNA:t=2.671,P<0.05;蛋白:t=7.417,P<0.01)的表达减少,迁移能力减弱(t=14.06,P<0.01);④提示RSL3通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4的表达,进而抑制病理性瘢痕成纤维细胞的纤维化和迁移能力。

初级纤毛介导成骨前体细胞系MC3T3-E1传代衰老减低成骨分化能力

背景:在大段骨缺损修复中,由于种子细胞传代等多种因素可引起成骨类细胞衰老,造成组织工程骨植入体内后成骨分化活性降低。近年来,初级纤毛介导细胞衰老的机制已被广泛研究,但“传代衰老-成骨活性减低”的初级纤毛相关机制尚未完全明了。目的:探讨初级纤毛调控成骨性MC3T3-E1细胞传代衰老的可能机制。方法:成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞传代至第10代(早期传代)及第40代(晚期传代),同时使用siRNA沉默IFT88阻碍初级纤毛生成,即将细胞分为第10代组、第40代组、第10代+siRNA IFT88-组、第40代+siRNA IFT88-组。各组细胞成骨诱导3 d,采用RT-PCR和Western blot检测衰老标志物CDKN2A(P16)的表达、成骨活性标志物骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶的表达、Hedgehog通路IHH的表达;茜素红染色和初级纤毛免疫荧光染色分析初级纤毛形态;对初级纤毛阳性率与IHH、骨形态发生蛋白2的表达进行Spearman相关性分析。结果与结论:①成骨诱导3 d,第40代组MC3T3-E1细胞的CDKN2A(P16)表达显著高于第10代组,而在siRNA IFT88-干预后差异消失;②第10代组的初级纤毛细胞阳性率高于第40代组,siRNA IFT88-则显著性抑制第10代与第40代细胞的初级纤毛表达;③第10代组MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶及骨形态发生蛋白2的转录活性和蛋白表达均高于第40代组,通过siRNA抑制初级纤毛表达后,上述差异减低或者消失;④初级纤毛细胞阳性率与IHH蛋白表达及骨形态发生蛋白2蛋白表达呈正相关。结果表明:初级纤毛介导了成骨性MC3T3-E1细胞的传代衰老,可调控成骨分化能力。

电磁脉冲辐射诱导小鼠成纤维细胞系NIH/3T3凋亡的研究

目的 研究电磁脉冲 (EMP)辐射对小鼠成纤维细胞系 (NIH/ 3T3)凋亡的影响 ,并探讨EMP对生物体损伤的可能机制。方法 利用场强为 6 0kV/m的EMP照射细胞后 ,采用细胞计数、MTT比色法、流式细胞术及免疫组化染色等方法 ,分别观察EMP对HIN/ 3T3细胞的活力、凋亡以及Bcl 2和 p5 3蛋白表达等的影响。对免疫组化染色阳性的细胞 ,在高倍镜下用CMIAS II图像 -分析系统进行图像分析 ,所有数据均经SPSS8.0软件进行分析。结果 EMP可明显抑制NIH/ 3T3细胞的增殖与活力 (P <0 .0 5 ) ;非贴壁细胞率在辐射后明显增加 ,6h达高峰 (33.9% ) ,并可诱导细胞明显凋亡 ,6h达高峰 (15 .0 7% )。图像分析结果表明 ,EMP辐射后 ,有不同程度的Bcl 2蛋白表达的下调及 p5 3蛋白表达的上调 (P <0 .0 5 )。结论 EMP可诱导NIH/ 3T3细胞凋亡及Bcl 2及p5 3蛋白异常表达 ,提示Bcl 2及p5 3可能参与了NIH/

力学拉伸通过STAT3/HIF-1a/PDK1轴介导角膜成纤维细胞糖酵解相关酶的表达

目的圆锥角膜是眼科临床常见的致盲疾病,具体发病机制尚不完全清楚,其中力学微环境变化不可忽略。研究表明圆锥角膜的发生可能和细胞能量代谢异常有关。探讨力学刺激对角膜成纤维细胞糖酵解相关酶表达的影响及其调控途径,可为深入理解圆锥角膜的发生发展机制提供新思路。方法通过FX5000系统对人角膜成纤维细胞施加频率0.1 Hz、幅度为15%的周期性力学牵拉;采用RNA干扰技术敲低STAT3和HIF-1α,用western blotting和q-PCR检测糖酵解相关酶的表达。结果力学拉伸可促进PDK1、糖酵解相关酶(GLUT1、HK2、LDH等)及STAT3、HIF-1α的表达。单独敲低STAT3或HIF-1α可显著下调PDK1、HK2、LDH的表达。敲低STAT3或HIF-1α后联合机械拉伸作用,则可显著上调HIF-1α和PDK1、GLUT1的表达。结论力学刺激通过STAT3/HIF-1α/PDK1途径调控了角膜成纤维细胞糖酵解相关酶的表达,可能会促进圆锥角膜的发生发展。

肺纤方对小鼠肺纤维化模型及NIH3T3成纤维细胞作用机制的研究

目的在前期二次造模实验基础上,建立小鼠肺纤维化模型,观察肺纤方对肺纤维化小鼠模型的干预作用,并探讨不同浓度的肺纤方煎剂对体外培养NIH3T3成纤维细胞细胞增殖的影响及可能的作用机制。方法将60只雄性昆明小鼠,随机取出其中50只,气管内雾化吸入博莱霉素(8 mg/kg)造模,造模第10天后再次给予吸入博来霉素(8 mg/kg)二次造模,第25天将其随机分为5组:模型组、甲泼尼龙组、肺纤方高、中、低剂量组,每组10只。其余10只小鼠气管内滴入及灌胃等容生理盐水作为空白对照组。处死后取肺脏标本进行肺组织肺泡炎、纤维化评价方法和肺组织羟脯氨酸(Hyp)测定。培养小鼠NIH3T3成纤维细胞,分为对照组、肺纤方低、中、高剂量组,分别给予生理盐水、低、中、高浓度剂量肺纤方煎剂处理,一段时间后进行平板克隆形成实验和Western blot法测定细胞增殖和CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表达水平。结果采用肺纤方各组及甲泼尼龙组小鼠肺泡炎、纤维化评分和Hyp含量均明显低于模型组(P<0.05),且肺纤方各组上述指标值随着肺纤方剂量的增加而降低,但高剂量组与甲泼尼龙组比较,无显著性差异(P>0.05);肺纤方各组具有抑制NIH3T3细胞的增殖能力,且呈时间依赖,但无浓度依赖性;肺纤方各组对CyclinD1和MMP2蛋白的表达均有下调,且一定范围内随药物浓度增加,CyclinD1蛋白表达下调越明显;同时肺纤方各组TIMP1蛋白的表达有所增加,但是差异不显著;而肺纤方各组GAPDH条带灰度比值无明显差异。结论肺纤方能够有效抑制博来霉素致小鼠肺纤维化,同时能抑制NIH3T3细胞的增殖,可能机制为其抑制CyclinD1蛋白表达和改善MMPs/TIMPs系统平衡,但上述效应与药剂浓度无正相关性。

ADAMTS-1对小鼠成纤维细胞转化生长因子及其下游信号通路PI3K/AKT的影响

目的探索含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS-1)对体外小鼠成纤维细胞(NIH3T3)转化生子因子(TGF-β1)及其下游信号通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)的影响。方法体外培养小鼠成纤维细胞,以ADAMTS-1为处理因素,按照不同浓度,将NIH3T3分为空白组、低浓度组(1 nM)、中浓度组(10 nM)、高浓度组(20 nM),通过RT-PCR检测细胞TGF-β1mRNA的表达情况,利用Western-blot观察细胞TGF-β1及磷酸化蛋白激酶B(pAKT)的蛋白表达情况。结果根据RTPCR图像显示,与空白组相比,其他各组TGF-β1mRNA的表达均下降,且随着浓度的增高,呈逐渐降低趋势(P<0.05)。根据Western-blot图像显示,与对照组相比,其他各组TGF-β1、pAKT的蛋白表达均下降,且随着浓度的增高,呈逐渐降低趋势(P<0.05)。结论 ADAMTS-1可能下调TGF-β1及其下游PI3K/AKT信号通路。

过表达ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1保护小鼠胚胎成纤维细胞避免凋亡

由于膳食原因,人体摄入ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比例过高,脂类代谢严重失衡.鉴于ω-3PUFAs获取困难而且人体无催化ω-6PUFAs向ω-3PUFAs转化的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,本研究体外扩增来源于秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因(fat-l)cDNA,构建了真核表达载体pEGFPC1-fat-1,将该基因转染入小鼠胚胎成纤维细胞;激发荧光与RT-PCR方法检测转染pEGFPC1-fat-1细胞表达该基因,气相色谱分析显示该转染细胞中ω-6PUFAs/ω-3PUFAs的比例降低;细胞抑制率实验显示转染细胞的MTT吸光值升高(P<0.05);双染法流式细胞仪分析转染细胞凋亡降低,结果表明fat-1基因即使在高浓度ω-6PUFAs的细胞毒作用下,依然能够发挥将ω-6PUFAs脱氢转化为与ω-3PUFAs的生理功能,抑制3T3细胞凋亡,促进细胞生长增殖,实现了较强的细胞保护功能.

建立人肝微粒体-小鼠3T3成纤维细胞模型评价5-羟基雷公藤内酯醇代谢产物的细胞毒性

目的:以环磷酰胺(cyclophosphamide,CPA)和他莫昔芬(tamoxifen,TMX)为模型药物,建立人肝微粒体-小鼠3T3成纤维细胞模型,并用该模型评价5-羟基雷公藤内酯醇(T8)代谢产物的细胞毒性。方法:采用人肝微粒体(加或不加NADPH)-小鼠3T3成纤维细胞模型,测定吸光度(A值)并计算细胞孵育液的EC50值和EC50shift,以EC50 shift评价代谢产物毒性。结果:模型药物CPA和TMX及创新药物T8的EC50 shift分别为0.34、>4.7和1.2,表明CPA和TMX的代谢物会分别增加和降低细胞毒性,而T8代谢产物不影响或稍许降低对细胞的毒性。结论:本实验成功建立人肝微粒体-小鼠3T3成纤维细胞模型,这为T8进入体内的安全性提供了一定依据,也为候选化合物开发初期在不合成代谢物的情况下初步评价代谢物的细胞毒性提供了一种体外方法。

负载成纤维细胞3D打印甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架的体外促血管化

背景:将种子细胞与3D生物打印技术相结合可特异性地构建各种组织和器官以满足组织修复的需求,但对于损伤组织促血管化的有关研究仍有待深入。目的:通过培养负载成纤维细胞的甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架获得上清液并与完全培养基按不同比例混合,以模拟组织修复过程中的细胞微环境,探究多种细胞微环境对内皮细胞促血管化的作用。方法:采用挤压式3D生物打印工艺制备负载成纤维细胞的甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架,制备水凝胶支架浸提液;将水凝胶支架浸提液与完全培养基按照1∶1、1∶2、1∶4的体积比混合获得条件培养基。将小鼠胚胎成纤维细胞BALB3T3、人脐静脉内皮细胞分别与完全培养基(对照组)、水凝胶支架浸提液共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖,活/死细胞染色分析细胞活性。采用3种条件培养基与完全培养基(对照组)分别与人脐静脉内皮细胞共培养,进行成管实验、血管基因检测与CD31免疫荧光染色。结果与结论:①扫描电镜下可见水凝胶支架呈多孔性结构,流变学结果显示该水凝胶具有良好的机械性能,CCK-8检测与活/死细胞染色显示该水凝胶支架浸提液无明显的细胞毒性。②成管实验显示,1∶1条件培养基组细胞成管总长度小于对照组(P<0.05),4组细胞成管分支数比较差异无显著性意义(P>0.05)。③qRT-PCR检测显示,对于血管内皮生长因子mRNA表达,培养第1天,1∶2条件培养基组低于1∶1条件培养基组(P<0.01);培养第3天,1∶2条件培养基组高于对照组(P<0.01);培养第5天,1∶2条件培养基组高于其他3组(P<0.01或P<0.0001),1∶1条件培养基组低于其他3组(P<0.05或P<0.01)。对于碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达,培养第1天,1∶1条件培养基组高于对照组、1∶4条件培养基组(P<0.01,P<0.05),1∶2条件培养基组高于对照组(P<0.05);培养第3天,1∶4条件培养基组高于对照组(P<0.05)。④培养第3天,1∶2条件培养基组CD31表达高于对照组、1∶4条件培养基组(P<0.05)。⑤结果表明该条件培养基可模拟组织损伤后血管再生微环境,进而促进内皮细胞的血管化进程,并且1∶2条件培养基促血管化效果最好。

肿瘤相关成纤维细胞中微小RNA-214-3p表达对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中微小RNA-214-3p(miR-214-3p)表达对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其作用机制。方法选取64例卵巢癌患者作为研究对象,根据化疗后无进展生存期分为铂部分敏感组和铂敏感组,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测2组患者卵巢癌组织中miR-214-3p相对表达量,比较不同临床特征患者的2年生存率;原代培养CAFs及正常卵巢成纤维细胞(NFs),采用qRT-PCR、免疫荧光实验检测CAFs和NFs中miR-214-3p、p62蛋白表达;通过CSIOVDB数据库检索SQSTM1基因在不同种类卵巢细胞中的表达水平;向CAFs瞬时转染miR-214-3p mimic(mimic组)和miR-214-3p mimic NC(NC组),将未转染CAFs设为对照组;留取各组细胞培养上清,建立卵巢癌细胞SKOV3与各组CAFs间接共培养模型,采用CCK-8法、DCFH-DA法、qRT-PCR及免疫印迹法分别检测不同培养条件下SKOV3细胞增殖率、顺铂半数抑制浓度(IC 50)、细胞活性氧(ROS)含量和miR-214-3p、顺铂耐药基因CCND1、自噬蛋白p62相对表达量。结果铂部分敏感组患者的miR-214-3p相对表达量低于铂敏感组,差异有统计学意义(P<0.01);不同国际妇产科联盟(FIGO)分期、铂部分敏感情况、miR-214-3p低表达情况患者的2年生存率比较,差异有统计学意义(P<0.01);卵巢CAFs中miR-214-3p相对表达量低于NFs,p62蛋白表达水平高于NFs,差异有统计学意义(P<0.01);CSIOVDB数据库在线分析显示,卵巢癌CAFs中的SQSTM1基因表达水平高于卵巢癌上皮细胞、NFs,差异有统计学意义(P<0.01);相较于与对照组CAFs、NC组CAFs间接共培养的SKOV3细胞,与mimic组CAFs间接共培养的SKOV3细胞的增殖率、顺铂IC 50、ROS含量降低,miR-214-3p相对表达量升高,CCND1mRNA和p62蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论CAFs中miR-214-3p表达与卵巢癌细胞对顺铂的敏感性相关,CAFs中miR-214-3p低表达可促进卵巢癌细胞增殖及ROS介导的自噬,进而降低卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

成纤维细胞特异敲除转录因子ATF3基因的小鼠模型构建

目的:构建成纤维细胞特异敲除转录因子ATF3基因的小鼠模型。方法:利用胚胎显微注射法构建在ATF3基因携带loxP位点的小鼠(ATF3^(fl/fl)),以成纤维细胞细胞特异性表达的Col1a2-Cre介导ATF3条件性敲除,筛选出成纤维细胞条件性敲除ATF3的小鼠(Col1a2-ERCre:ATF3^(fl/fl));取鼠尾DNA进行PCR鉴定基因型,腹腔注射他莫昔芬诱导该基因敲除;12只敲除小鼠和12只同窝野生型小鼠各分为心脏缺血再灌注(I/R)组和假手术(sham)组,术后2h取心脏组织研磨后流式细胞分选成纤维细胞,进而提取mRNA并反转为cDNA,采用实时荧光定量PCR检测ATF3的表达;另取4只敲除小鼠和4只同窝野生型小鼠复制I/R模型,术后6h取心脏组织进行免疫荧光染色,观察成纤维细胞ATF3表达。结果:鼠尾DNA PCR鉴定基因型结果显示Cre基因型为阳性,ATF3 loxP基因型为纯合阳性;与假手术组相比,野生型小鼠术后心脏成纤维细胞ATF3表达明显升高[(0.02534±0.002654)vs.(0.5982±0.03495),P<0.0001],与术后野生型小鼠相比,术后条件性敲除组心脏成纤维细胞ATF3表达明显降低[(0.5982±0.03495)vs.(0.06456±0.005704),P<0.0001];免疫荧光共定位染色显示野生型小鼠心脏成纤维细胞ATF3蛋白表达,条件性敲除小鼠ATF3蛋白未见表达。结论:成纤维细胞特异敲除ATF3小鼠构建成功,为进一步实验奠定基础。