高糖诱导分化对3T3-L1成熟脂肪细胞线粒体形态和功能的影响

目的观察高糖诱导分化对3T3-L1成熟脂肪细胞葡萄糖转运以及线粒体功能的影响。方法 3T3-L1前体脂肪细胞分别在含25 mmol/L葡萄糖(高糖组)及5 mmol/L葡萄糖(低糖组)的DMEM培养基中诱导分化。采用油红"O"染色法观察细胞的分化程度,采用液闪仪检测成熟脂肪细胞对[3H]-2-脱氧葡萄糖的摄取率,采用透射电镜观察脂肪细胞的线粒体形态,生物发光法检测脂肪细胞内ATP。结果两组3T3-L1前体脂肪细胞均可分化为成熟脂肪细胞,高糖组成熟脂肪细胞体积及胞质内脂滴均较低糖组大;高糖组成熟脂肪细胞基础状态及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率均低于低糖组脂肪细胞;高糖组成熟脂肪细胞线粒体形态异常,细胞内ATP的含量为(63.00±2.48)nM/mg protein,低糖组为(102.00±1.39)nM/mg protein,两组比较,P<0.05。结论采用含25mmol/L或5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养,对3T3-L1前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化进程无明显影响;高糖诱导分化可致成熟脂肪细胞产生胰岛素抵抗和线粒体功能损伤。

葛根素对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响及机制研究

目的:探讨葛根素对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的影响及可能的作用机制。方法:将3T3-L1脂肪细胞分为7组,即对照组(control组)、葛根素3μmol/L组、葛根素10μmol/L组、葛根素30μmol/L组、葛根素100μmol/L组、葛根素300μmol/L组和阳性对照组(罗格列酮10μmol/L组,RGZ组),每组6孔。采用MTT法检测细胞增殖,油红O染色法检测细胞分化。利用地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞IR模型,并给予不同浓度的葛根素进行干预,测定葡萄糖利用情况,利用细胞转染过表达TLR2(命名为Pue+oe-TLR2组);蛋白质免疫印迹法(western blotting)测定TLR2蛋白水平;酶联免疫吸附试验测定干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果:与control组相比,葛根素各剂量组3T3-L1脂肪细胞的增殖率均无显著变化(P>0.05)。与control组相比,葛根素各剂量组3T3-L1脂肪细胞的分化明显增加(P<0.05)。与control组相比,葛根素各剂量组IR 3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量显著提高(P<0.05);葛根素各剂量组IR 3T3-L1脂肪细胞中TLR2表达量、IFN-γ分泌量降低,GLUT4和PPARγ的水平升高(P<0.05)。Pue+oe-TLR2组TLR2的相对表达量及IFN-γ分泌量显著高于Pue+oe-NC组,PPARγ、GLUT4的相对表达量显著低于Pue+oe-NC组(P<0.01)。结论:葛根素可提高IR 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗,缓解IR,其机制可能与抑制TLR2表达进而降低IFN-γ分泌有关。

木犀草苷对3T3-L1前脂肪细胞分化和脂代谢的影响

目的:研究木犀草苷对3T3-L1前脂肪细胞分化和脂代谢的影响及其作用机制。方法:采用3T3-L1前脂肪细胞,利用四甲基偶氮唑蓝法检测不同质量浓度木犀草苷对3T3-L1前脂肪细胞毒性的影响;使用鸡尾酒诱导法诱导细胞分化,用油红O染色观察脂滴形成情况;测定分化后细胞中甘油三酯、总胆固醇的含量以及相关炎症因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、瘦素(leptin,LEP)和脂联素(adiponectin,ADPN)的分泌量;利用Western Blot法检测细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptor,PPAR)γ、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT-enhancer-binding proteins,C/EBP)-α、固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP1)、PPARα、解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP-1)、肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT-1)蛋白的相对表达水平。结果:3T3-L1前脂肪细胞存活率随木犀草苷质量浓度的升高整体呈降低趋势,木犀草苷质量浓度在5~60μg/mL时细胞存活率均在80%以上。木犀草苷处理组可显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,减少脂质积累;木犀草苷可下调成脂分化后细胞中总胆固醇、甘油三酯的含量以及炎症因子TNF-α、IL-6和LEP的分泌量,上调IL-10和ADPN的分泌量;木犀草苷能下调PPARγ、C/EBP-α和SREBP1蛋白的相对表达水平,上调PPARα、UCP-1和CPT-1蛋白的相对表达水平。结论:木犀草苷可以抑制3T3-L1前脂肪细胞分化和影响脂代谢,其机制一方面是下调PPARγ、C/EBP-α和SREBP1蛋白表达,抑制脂肪合成;另一方面是激活PPARα上调下游蛋白,促进脂肪消耗;木犀草苷还可能通过调节细胞因子的分泌量,促进细胞脂解,从而改善脂代谢失衡。

山药多糖对地塞米松诱导IR-3T3-L1脂肪细胞的降血糖作用及机制研究

目的探究山药多糖(Chinese yam polysaccharide,CYPS)在地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导的3T3-L1胰岛素抵抗(IR-3T3-L1)细胞模型中的降血糖作用。方法将IR-3T3-L1脂肪细胞随机分为对照组(Con)、DEX组(DEX)、Met组(Met,阳性药组)、CYPS组(0.05、0.15、0.45 mg/mL),通过DEX(1μmol/L)诱导建立IR-3T3-L1细胞模型,进行给药后细胞对葡萄糖的消耗量和细胞中血脂(总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C))与丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)含量的检测,并采用qRT-PCR对AMPK-PI3K/Akt信号通路中相关基因表达进行检测。结果DEX组与Con组相比,1μmol/L DEX处理48 h显著降低了IR-3T3-L1细胞的葡萄糖消耗量(P<0.01),且在60 h内维持稳定。0.05、0.15、0.45 mg/mL CYPS处理IR-3T3-L1细胞显著增加了细胞中葡萄糖的消耗(P<0.01)、HK、PK、GSH-Px酶活性(P<0.01)、HDL-C含量(P<0.01);降低了MDA酶活性(P<0.01)、T-CHO、TG、LDL-C含量(P<0.01)。同时,CYPS可以显著回调PI3K、Akt、GLUT-4、AMPK、IRS-2、PPARa、Adiponectin的mRNA水平(P<0.05),降低IRS-1、GSK-3β、ACC、FAS的mRNA表达水平(P<0.01)。结论CYPS能够改善DEX诱导的IR-3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗,调节脂代谢紊乱,缓解氧化应激,其作用机制可能通过调控IR-3T3-L1脂肪细胞的AMPK-PI3K/Akt信号通路来实现糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗调节来实现。

Nesfatin-1对3T3-L1脂肪细胞糖代谢和自噬的影响

为探讨厌食肽Nesfatin-1对脂肪细胞糖代谢和自噬的影响,本试验通过体外诱导分化3T3-L1前脂肪细胞,并在高糖状态下,以Nesfatin-1干预1 h之后,采用非放射性荧光法、ELISA、实时荧光定量PCR和Western blot分别检测脂肪细胞的葡萄糖摄取水平、丙酮酸含量、己糖激酶和磷酸果糖激酶活性以及自噬因子LC3、p62和Beclin-1 mRNA和蛋白表达量。结果显示,3T3-L1前脂肪细胞经过8 d诱导可达到完全分化状态;与对照组相比,经过Nesfatin-1处理后,3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取水平极显著降低(P<0.01),己糖激酶和磷酸果糖激酶的酶活性均非常显著地降低(P<0.001),p62 mRNA和蛋白表达量极显著下降(P<0.01),但丙酮酸含量、Beclin-1 mRNA以及LC3 mRNA和蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。结果提示,Nesfatin-1不仅能有效降低3T3-L1脂肪细胞的糖消耗能力,还能上调脂肪细胞的自噬水平。

EGCG调控3T3-L1脂肪细胞向棕色脂肪分化的作用与机制研究

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)调控3T3-L1脂肪细胞向棕色脂肪分化的作用与机制。方法培养3T3-L1脂肪细胞并诱导其分化,通过MTT法检测不同EGCG浓度对细胞增殖的影响,选取浓度为10、50、100μmol/L的EGCG处理3T3-L1脂肪细胞,空白对照组不做处理。采用AMPK抑制剂Compound C和AMPK激活剂AICAR分别处理3T3-L1脂肪细胞。油红O染色观察EGCG对3T3-L1细胞分化的影响;qRT-PCR法和Western blot法检测3T3-L1脂肪细胞分化及褐化相关因子及蛋白的表达水平;用Mito-tracker-Green探针检测线粒体荧光。结果随EGCG浓度的增加,3T3-L1细胞的脂滴减少,且呈一定浓度依赖性。加入AMPK激活剂AICAR可进一步减少脂滴,而加入AMPK抑制剂Compound C可逆转脂滴减少情况。随EGCG浓度的升高,PPARr、FASN mRNA及蛋白的表达水平均降低,UCP1、PGC-1α、Nrf1、Tfam、ATGL、HSL、AMPK mRNA及蛋白表达水平均升高(均P<0.05),加入AMPK激活剂AICAR可进一步加重此趋势,而加入AMPK抑制剂Compound C可逆转此趋势。荧光显微镜观察发现EGCG处理后荧光强度相对于对照组显著增强。结论EGCG通过调控3T3-L1脂肪细胞AMPKα/PGC-1α信号途径促进脂肪细胞棕色化和线粒体生物合成。

重组糖蛋白激素β5/α2调控cAMP/PKA/CREB通路促进3T3-L1细胞脂肪分解的作用及机制研究

目的研究重组糖蛋白激素β5/α2(rCGH)对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响,并探究其潜在机制。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化为成熟脂肪细胞,给予不同浓度rCGH干预24 h。以CCK-8法检测3T3-L1脂肪细胞的细胞活力,酶学方法测定细胞内甘油三酯(TG)及培养上清中甘油的水平,油红O染色观察脂滴变化。Western blot检测各组脂肪细胞中HSL和ATGL脂解蛋白的表达水平。不同浓度rCGH加或不加PKA抑制剂H89对已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞进行联合干预实验,将培养细胞分为对照组、H89预处理组、1μmol·L^(-1)rCGH组和(1μmol·L^(-1)rCGH+H89)联合干预组。酶法测定胞内TG及游离甘油的含量,Western blot检测CREB及脂解相关蛋白的表达。结果不同浓度rCGH(0.25、0.5、1、2μmol·L^(-1))对脂肪细胞细胞活力无显著影响(P>0.05);与对照组相比,rCGH处理显著降低了脂滴大小和细胞内TG含量,同时显著升高了细胞上清液中的甘油浓度。rCGH处理还刺激了p-HSL、ATGL和p-PKA的蛋白表达。此外,加入PKA抑制剂H89,减弱了rCGH对游离甘油水平、细胞内TG含量以及p-HSL、p-PLIN1和p-CREB表达的影响。结论rCGH通过上调HSL、ATGL和PKA活性促进3T3-L1脂肪细胞的脂质分解,促进甘油释放,抑制TG合成和脂质积累,其作用机制与cAMP/PKA/CREB信号通路激活有关。

高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响和机制研究

目的探讨高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响和机制。方法本研究选取2022年9月—2023年2月珠海市人民医院·暨南大学附属珠海医院3T3-L1前脂肪细胞为研究对象,使用MTT法评估高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1细胞增殖的影响。通过油红O染色检测分析高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1细胞分化的影响。应用实时定量聚合酶链锁反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法检测高良姜二苯庚烷化合物对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/Enhancer Binding Proteinα,C/EBPα)基因mRNA表达的调控作用。通过Western blot分析检测高良姜二苯庚烷化合物对PPARγ和C/EBPα蛋白表达的影响。结果高良姜二苯庚化合物(0、0.05、0.2、0.4 g/L)在24、48 h对前脂肪细胞的生长表现为增殖趋势,呈现一定的量效关系,其中高良姜二苯庚烷化合物浓度为0.4 g/L时3T3-L1增殖[(7.02±0.35)、(17.23±0.95)g/L]高于与对照组,差异有统计学意义(t=13.794、10.843,P均<0.05)。高良姜二苯庚烷化合物呈剂量依赖性地抑制了3T3-L1细胞的增殖。油红O染色结果显示,高良姜二苯庚烷化合物处理显著抑制了3T3-L1细胞的脂肪细胞分化,并减少了脂滴的积累;100μmol/L处理组,PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平显著降低。高良姜二苯庚烷化合物通过抑制PPARγ和C/EBPα基因的表达,调控了3T3-L1前脂肪细胞的分化过程,从而减少了脂肪滴的积累。结论高良姜二苯庚烷化合物抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,其机制与PPARr/EBPα的低表达有关。

丁香酚通过激活cAMP抑制3T3⁃L1前脂肪细胞分化

为研究丁香酚对3T3⁃L1前脂肪细胞成脂分化过程的影响及其分子机制,以未分化的3T3⁃L1前脂肪细胞为对照组,3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和罗格列酮诱导分化的成熟脂肪细胞为模型组,探究3T3⁃L1细胞分化过程中的丁香酚处理对脂质积累的影响;使用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536处理细胞,探究环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)在丁香酚抑制脂质积累中发挥的关键作用。结果表明,与模型组相比,50µmol/L丁香酚处理显著降低脂质含量(P<0.0001),显著升高胞内cAMP水平(P<0.01)。当培养基中存在SQ22536时,丁香酚对3T3⁃L1细胞成脂分化过程中脂质积累的抑制作用由24.7%被削弱至6.7%,而丁香酚对细胞内cAMP水平的促进效果被完全消除。实时荧光定量聚合酶链式反应分析结果表明,丁香酚显著下调3T3⁃L1细胞成脂分化过程中脂质生成基因CEBPα(P<0.05)和aP2(P<0.01)的表达,显著上调产热相关基因UCP1的表达(P<0.01);SQ22536处理削弱或完全消除丁香酚对3T3⁃L1细胞脂质积累的抑制作用。因此,丁香酚可有效抑制3T3⁃L1细胞脂质积累,其作用机制与cAMP的激活有关。

基于HIF-1α/自噬途径探讨二氯化钴调控3T3-L1脂肪细胞炎症反应及胰岛素抵抗的机制

目的探讨低氧诱导剂二氯化钴(CoCl_(2))调控3T3-L1脂肪细胞自噬活性从而改善脂肪细胞炎症反应和胰岛素抵抗的机制。方法常规培养和诱导分化3T3-L1脂肪细胞成为成熟的脂肪细胞,CoCl_(2)作为低氧诱导剂在不同时间、不同浓度条件下干预成熟的脂肪细胞,确认CoCl_(2)干预脂肪细胞自噬活性的最佳时间和浓度,随后根据此时间和浓度分组,分为0 h(对照组)、12 h、24 h、48 h CoCl_(2)处理组,收集细胞样本进行相关指标测定。MTT法评价各组细胞存活情况;Western blot分析各组细胞HIF-1α及其下游蛋白葡萄糖转运蛋白Glut-1、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达情况;免疫荧光法检测各组细胞的自噬水平;ELISA法检测各组细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6分泌情况。结果150μmol/L CoCl_(2)是调控3T3-L1脂肪细胞自噬水平的最佳干预浓度;150μmol/L CoCl_(2)干预成熟的脂肪细胞24 h时,自噬活性水平增高,细胞存活率无显著的减低,脂肪细胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Glut-1蛋白的表达水平也显著升高,但炎症因子TNF-α和IL-6分泌水平无明显增加;48 h时自噬水平减低,细胞存活率出现显著减低,脂肪细胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Glut-1蛋白的表达水平减低,炎症因子TNF-α和IL-6分泌水平出现增加趋势。结论150μmol/L CoCl_(2)可以调控脂肪细胞自噬水平增加,自噬水平的增加以依赖HIF-1α的方式活化,从而使自噬发挥保护脂肪细胞的作用使其免受炎症损伤和改善脂肪细胞胰岛素抵抗。

荷叶水提物对3 T3-L1前体脂肪细胞增殖、凋亡及前体脂肪细胞、成熟脂肪细胞IL-6 mRNA、TNF-αmRNA的影响

目的:研究荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、凋亡的影响,以及对3T3-L1前体脂肪细胞、成熟脂肪细胞白介素-6(IL-6)信使核糖核酸(mRNA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA的影响.方法:体外培养3T3-L1细胞,采用MTT法检测荷叶水提物对3T3-L1前体脂肪细胞增殖的影响;采用荧光定量PCR检测其对3T3-L1前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞IL-6 mRNA、TNF-αmRNA的表达,采用DAPI染色法检测其对3T3-L1前体脂肪细胞凋亡的影响.结果:不同质量分数的荷叶水提物均能抑制3T3-L1细胞增殖,且呈现量-效关系;1 g/L荷叶水提物可增高3T3-L1成熟脂肪细胞TNF-αmRNA和IL-6 mRNA的表达,降低3T3-L1前体脂肪细胞TNF-αmRNA的表达;还可以促进3T3-L1前体脂肪细胞的凋亡.结论:荷叶水提物可能是通过抑制细胞增殖、降低细胞炎症因子mRNA的表达、促进细胞凋亡进而影响脂肪细胞的活性.

紫色悬钩子提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

目的研究紫色悬钩子提取物对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响,进一步探讨紫色悬钩子对脂肪细胞代谢的潜在机制,为肥胖症的预防和治疗提供新依据。方法MCI中压色谱柱分离制备紫色悬钩子提取物。MTT法检测细胞增殖,油红O染色及试剂盒检测分析细胞的脂质积累水平。Western blot检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)、腺苷5′-单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)及磷酸化的AMPK(p-AMPK)蛋白的表达。结果当紫色悬钩子提取物的质量浓度≤100 mg·L^(-1)时,对细胞活力的影响无明显变化(P<0.05),其中Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5可降低细胞中脂质的积累(P<0.05)。Fr.1低剂量组(10 mg·L^(-1))和Fr.4的高剂量组(100 mg·L^(-1))可以减少细胞中总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)含量,降低PPARγ、C/EBPα,升高p-AMPK的蛋白表达(P<0.05)。结论紫色悬钩子提取物可能是通过激活AMPK蛋白,抑制PPARγ信号通路相关蛋白的表达,从而降低细胞中脂质的积累。

多花黄精提取物体外干预3T3-L1前脂肪细胞并缓解其脂质积累

研究多花黄精提取物对3T3-L1前脂肪细胞以及分化后成熟脂肪细胞的作用。用φ=70%乙醇和复合酶(纤维素酶:木瓜蛋白酶=3:7)为提取剂,分别提取出多花黄精生品乙醇提取物(Raw Products Extract,RPE)、多花黄精九蒸九制品乙醇提取物(Processed Products Extract,PPE)和多花黄精生品多糖(Polysaccharide from Polygonatum cyrtonema Hua,CPP),得到的九蒸九制品提取物中多糖质量百分比减少(RPE 29.83%,PPE 1.92%),但表现出更高的皂苷、总黄酮和总酚含量(13.63%、5.37 mg/g、14.52 mg/g)。各多花黄精提取物处理3T3-L1细胞后,均观察到3T3-L1前脂肪细胞被阻滞在G0/G1和S期,细胞被诱导凋亡从而抑制细胞的增殖,成熟脂肪细胞内脂滴沉积累量和甘油三酯(Triglyceride,TG)所占比例显著降低,且高剂量组的PPE(380μg/mL)对降低TG占比的效果最显著,与市售多花黄精九蒸九制品多糖(Polysaccharides from Purchased Products,PP)无显著差异。此外,脂肪生成和脂肪酸氧化有关基因也可受到调控,包括抑制PPARγ、C/EBPα、FABP4和LPL的mRNA表达,促进CPT-1的mRNA表达。结果提示,多花黄精提取物可防止脂肪细胞在体外积聚脂肪,表明多花黄精可能具有抗肥胖作用。

茶褐素对3T3-L1成熟脂肪细胞基因差异表达的影响

肥胖在细胞水平上主要是脂肪细胞蓄积甘油三酯和前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的能力决定的。本研究显示,茶褐素RTB(粗TB)、TB1(MW>50ku)、TB2(5ku<MW<50ku)以及TB3(MW<5ku)作用3T3-L1成熟脂肪细胞72 h后,可显著抑制其增殖,而对3T3-L1前脂肪细胞的增殖作用影响不大。通过转录组学分析发现,不同分子质量的茶褐素对3T3-L1成熟脂肪细胞基因差异表达明显。从显著富集通路中筛选出以下差异基因:相对于正常对照组,RTB-100组的DNA聚合酶ε和δ显著上调,核糖核苷二磷酸还原酶α2、RNA聚合酶(β、I、I、III(RPABC5))、线粒体3-甲基巴豆酰Co A羧化酶β、核糖核苷二磷酸激酶7、CTP合成酶、驱动蛋白、CYP450、线粒体BCAAs转氨酶的表达显著下调。TB1-100组的二氢硫辛酸脱氢酶显著上调,线粒体三功能酶(α、β)、胞质乙酰转移酶、线粒体脂酰基Co A脱氢酶、BCAAs转氨酶的表达显著下调。TB2-100组的G-CSF、NF-κB(α、β、p105)、趋化因子(CXC10、14,CC2)显著上调,IRGM、Hbα2、IκBα、糖原磷酸化酶、IL-10、E2F3、VEGF(A、B)、丙酮酸激酶(M1/M2)、低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP显著下调。TB3-100组的G-CSF、TN-FSF12、TNFRSF1和TNFRSF 19、趋化因子(CXC14、CC)、IL-1、IL-17、IL-24、IL-2、IL-11显著上调,EGF、VEGF3、VEGF102显著下调。这说明前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞达到80%时,加入不同分子质量的茶褐素(100 mg/L)干预,可引起细胞中相关通路及基因表达的显著变化,且不同分子质量的茶褐素所致基因表达谱差异明显,TB2作用最强烈。

芪丹颗粒通过促进CTRP3激活PI3K/AKT信号通路改善脂肪细胞胰岛素抵抗

【目的】探究芪丹颗粒抗脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)机制。【方法】采用棕榈酸培养法诱导3T3-L1脂肪细胞IR模型,设空白对照组,模型组,芪丹颗粒低、中、高剂量组,芪丹颗粒+C1q/TNF相关蛋白3(CTRP3)siRNA组。测定细胞上清中葡萄糖消耗量;采用酶联免疫吸附分析(ELISA)法测定细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)含量;实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞CTRP3、TNF-α、IL-6、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因表达;Western Blot法检测细胞中CTRP3、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)的蛋白表达及其磷酸化水平。【结果】与模型组比较,芪丹颗粒中、高剂量组的葡萄糖消耗量升高并趋于空白对照组的70%~82%,TNF-α含量降低了25%~45%,IL-6含量下降了40%~55%,GLUT4 mRNA表达水平增加了50%,CTRP3 mRNA及蛋白表达水平增加了25%~40%(均P<0.05);与芪丹颗粒组比较,芪丹颗粒+CTRP3 siRNA组的葡萄糖消耗量和GLUT4 mRNA表达水平分别降低了33%和27%,IL-6和TNF-α的含量分别增加了42%和41%,p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平增加了190%和180%(均P<0.05)。【结论】芪丹颗粒可能通过促进CTRP3表达降低炎症反应和激活PI3K/AKT信号通路来提高IR 3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性,改善脂肪细胞IR。

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将siMAX、siNC转染3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP 4基因相对表达量,利用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平。【结果】在3T3-L1细胞的成脂分化过程中,与第0天相比,第2、4、6和8天miR-137-3p相对表达量均极显著降低(P<0.01);与NC组相比,miR-137-3p mimics组脂滴明显减少、变小,C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP 4基因相对表达量极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05),C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达下调,miR-137-3p inhibitor组油红O观察结果、成脂分化标志基因mRNA和蛋白表达情况则与之相反。靶基因预测结果表明,MAX的3′-UTR区序列与miR-137-3p存在预测结合位点,且在不同物种间具有高度保守性。双荧光素酶报告试验显示,miR-137-3p mimics组3′-UTR-WT双荧光素酶活性极显著降低(P<0.01);与NC组相比,mimics组MAX基因表达水平极显著降低(P<0.01)、inhibitor组显著升高(P<0.05)。与siNC组相比,敲低MAX基因表达,脂滴明显减少、变小,C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP 4基因mRNA表达水平极显著下调(P<0.01),C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达下降。【结论】内源性miR-137-3p在3T3-L1细胞的成脂分化过程中表达水平降低,miR-137-3p可能通过下调MAX基因的表达抑制3T3-L1细胞成脂分化。

甘露聚糖结合凝集素对脂多糖诱导的3T3-L1脂肪细胞炎症反应和胰岛素抵抗的调节作用及机制

目的:研究甘露聚糖结合凝集素(MBL)对脂多糖的诱导3T3-L1脂肪细胞炎症反应及胰岛素抵抗的调节作用及机制。方法:诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,油红O染色分析细胞分化程度,使用CCK-8检测分化过程中MBL(1、10、20μg/ml)及LPS对细胞增殖能力的影响;ELISA检测细胞炎症因子IL-6、TNF-α含量,Western blot检测TNF-α、IL-6及TLR4/NF-κB信号通路中蛋白表达,并分析Akt、IRS-1 try蛋白磷酸化及GLUT4表达情况;流式细胞术检测MBL对3T3-L1细胞摄取葡萄糖的调节作用。结果:油红O染色显示,12 d时,3T3-L1前体脂肪细胞已诱导为完全成熟的脂肪细胞;CCK-8结果证实,在细胞分化全过程,不同浓度的MBL (1、10、20μg/ml)及LPS对其增殖能力无明显影响;ELISA及Western blot结果显示在脂肪细胞分化至成熟过程中,MBL处理均可抑制LPS诱导的炎症因子分泌,且其抑制作用呈浓度依赖性;Western blot结果显示MBL以浓度依赖的方式抑制LPS诱导的IκB、IKK磷酸化和TLR4以及核NF-κB表达,且MBL可增强Akt和IRS-1磷酸化,增加GLUT4表达;流式细胞术结果显示MBL可以在一定程度上解除LPS对3T3-L1细胞摄取葡萄糖的抑制,并呈一定的浓度依赖性。结论:在脂肪细胞中,MBL通过TLR4/NF-κB信号通路抑制细胞炎症因子分泌,发挥抑炎作用;MBL通过抑制炎症因子分泌,解除LPS对3T3-L1细胞摄取葡萄糖和IRS-1/Akt信号的抑制,减轻胰岛素抵抗。

VPS13A在3T3-L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究

目的:明确囊泡分选蛋白13A(vacuolar protein sorting 13 homolog A,VPS13A)在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embry-onic fibroblast cells,3T3-L1)分化过程中的表达水平;探索VPS13A对3T3-L1细胞的影响。方法:利用Western blot及Q-PCR法检测3T3-L1细胞在分化过程中VPS13A的表达,利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系,Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3-L1细胞分化的影响。结果:VPS13A的表达在3T3-L1分化过程的早期降低,在分化的后期升高。敲降VPS13A后,3T3-L1细胞中脂滴增多,参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论:在3T3-L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控,敲降VPS13A可以促进3T3-L1细胞的分化成熟。

新型SIRT1激活剂XZG2151对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

目的探讨新型沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)激活剂化合物XZG2151对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。方法将3T3-L1前脂肪细胞分成4组:3T3-L1细胞组(Pre组)、DMSO组(Ctrl组)、阳性对照组(SRT2104组)、实验组(XZG2151组)。采用CCK8法检测XZG2151对3T3-L1细胞增殖的影响。油红O染色法、甘油含量测定法观察XZG2151对3T3-L1细胞中脂肪形成的影响。实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹法检测XZG2151对3T3-L1细胞分化过程中相关基因和蛋白表达水平的影响。结果10μmol/L XZG2151对3T3-L1前脂肪细胞的增殖无显著影响(P>0.05)。与Ctrl组相比,SRT2104组和XZG2151组3T3-L1细胞脂肪含量显著降低(P<0.05)。与Ctrl组相比,XZG2151组SIRT1、激素敏感脂肪酶(HSL)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)的mRNA表达水平显著升高(P<0.05);脂肪合成转录因子PPARγ和C/EBPβ、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、乙酰辅酶A羟化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FASN)的mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。此外,与Ctrl组相比,XZG2151组SIRT1、p-ACC、CPT1A蛋白表达显著升高(P<0.05),FASN蛋白表达显著下降(P<0.05)。结论XZG2151可调节3T3-L1前脂肪细胞的脂肪生成和脂质代谢,从而抑制前脂肪细胞分化。

Adiponutrin mRNA在分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中的表达

随着研究的深入,现已发现脂肪组织是全身较为重要的内分泌器官。脂肪产生的因子包括瘦素、脂联素、TNF-α、IL-6和Perilipin等。已经证实许多脂肪产生的蛋白在能量平衡方面有着重要的作用。Adiponutrin是新近发现的一种非分泌蛋白[1],它主要表达在脂肪组织中。