PD-1、ICOS、4-1BB与食管癌的关系

食管癌一直以来是我国最常见的肿瘤之一,而其诊断阶段是判定患者生存预后的关键。然而,大多数食管癌病例在晚期才被诊断出来,其治疗方案有限,生存率低。研究显示食管癌有许多相关的相关免疫因素,其中包括程序性死亡蛋白-1 (Programmed Death-1, PD-1)及其配体程序性蛋白死亡配体-1 (Programmed Death Ligand-1, PD-L1)呈现出显著的疾病相关性。此外,促进抗肿瘤T细胞功能的其他机制是T细胞表面表达的共刺激分子,如4-1BB、ICOS,它们可以诱导细胞因子的产生、抗凋亡分子的表达和免疫反应增强。本文探讨PD-1、ICOS、4-1BB与食管癌的联系,提供了新的思路来寻找改进食管癌的诊断和预后的生物标志物。

OGTT不同时间点血糖值异常及血清PD-1、4-1BB水平与妊娠期糖尿病患者不良妊娠结局相关性分析

目的:探讨75 g葡萄糖耐量试验(OGTT)在不同时间点血糖值异常及血清程序性死亡受体1(PD-1)、4-1BB因子水平与妊娠期糖尿病(GDM)患者不良妊娠结局的相关性。方法:选取收治的400例GDM患者为研究对象。根据OGTT检测结果将患者分为服糖前血糖异常组(108例)、服糖后1 h血糖异常组(97例)、服糖后2 h血糖异常组(110例)、服糖前后血糖异常组(85例)。比较各组间一般资料及妊娠结局。根据妊娠结局将患者分为妊娠结局不良组(133例)和妊娠结局良好组(267例),比较两组间血清PD-1、4-1BB水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清PD-1、4-1BB对GDM患者不良妊娠结局的预测价值。结果:服糖前后血糖异常组在孕周及血糖控制方法中与服糖前血糖异常组、服糖后1 h血糖异常组和服糖后2 h血糖异常组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。服糖前后血糖异常组孕妇剖宫产及巨大儿发生率高于服糖前血糖异常组、服糖后1 h血糖异常组和服糖后2 h血糖异常组(均P<0.05)。与妊娠结局良好组比较,妊娠结局不良组血清PD-1水平降低,4-1BB水平升高(均P<0.05)。ROC曲线结果显示,血清PD-1、4-1BB对GDM患者不良妊娠结局具有一定预测价值(均P<0.05)。结论:75 g OGTT不同时间点血糖值异常及血清PD-1、4-1BB水平与GDM患者不良妊娠结局有关,PD-1、4-1BB对GDM患者不良妊娠结局具有一定预测价值。

隔药饼灸对环磷酰胺诱导免疫抑制兔共刺激分子CTLA-4、4-1BB、CD28的影响

目的探讨隔药饼灸对环磷酰胺诱导免疫抑制兔共刺激分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、4-1BB、CD28的影响。方法选择大耳白兔32只,随机分为空白组、模型组、艾条灸组和隔药饼灸组,每组8只。模型组、艾条灸组和隔药饼灸组予环磷酰胺诱导免疫抑制模型。模型制备成功次日,艾条灸组和隔药饼灸组分别予艾条灸和隔药饼灸,隔日1次,共10次。空白组和模型组不予艾灸。艾条灸组和隔药饼灸组末次干预次日,空白组和模型组同时间,采集腹腔静脉血,离心留取血清,采用ELISA法检测血清CTLA-4、4-1BB、CD28;腹腔静脉取血后,摘取脾脏和肝脏,免疫组化法检测脾脏和肝脏组织CTLA-4、4-1BB蛋白表达。结果模型组血清CTLA-4、CD28水平均高于空白组,血清4-1BB水平低于空白组(P均<0.05);与模型组比较,艾条灸组和隔药饼灸组血清CTLA-4、CD28水平均降低,血清4-1BB水平均升高(P均<0.05);与艾条灸组比较,隔药饼灸组血清CTLA-4、CD28水平均降低,血清4-1BB水平升高(P均<0.05)。模型组脾脏和肝脏组织CTLA-4阳性表达均高于空白组,4-1BB阳性表达均低于空白组(P均<0.05)。与模型组比较,艾条灸组脾脏和肝脏组织CTLA-4阳性表达均降低(P均<0.05),肝脏组织4-1BB阳性表达升高(P<0.05),而脾脏组织4-1BB阳性表达升高不明显(P>0.05);隔药饼灸组脾脏和肝脏组织CTLA-4阳性表达均降低(P均<0.05),4-1BB阳性表达均升高(P均<0.05)。艾条灸组与隔药饼灸组脾脏和肝脏组织CTLA-4、4-1BB阳性表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论隔药饼灸能够通过调节共刺激分子CTLA-4、4-1BB、CD28而改善环磷酰胺诱导免疫抑制兔的免疫功能,其效果优于艾条灸。

人4-1BBL胞外区基因的克隆与表达研究

用RTPCR方法从人单核THP1细胞系克隆人41BBL胞外区基因,将其重组到pAYZ表达载体中,构建成人41BBL胞外区基因表达载体。将该载体转化大肠杆菌16C9,获得稳定表达,表达产物主要以可溶性状态存在;SDSPAGE和Westernblot分析显示,其分子量约为22kD,与预期结果一致。这是首次在大肠杆菌中获得41BBL胞外区可溶性表达。生物学活性检测显示41BBL对于维持T淋巴细胞系因子释放非常有益,同时PI单染表明它能抑制Jurkat细胞的凋亡。这将在抗肿瘤免疫治疗中具有潜在应用前景。

协同刺激分子4-1BB和CD28对人外周血不同T细胞亚群的激活作用

目的 :探讨 4 1BB/ 4 1BBL协同刺激信号在CD4 + 和CD8+ T细胞活化、增殖中的作用 ,并与CD2 8/B7信号作比较。方法 :用抗CD3单抗 (mAb)刺激人外周血单个核细胞 (PBMC)。用阻断型抗 4 1BBLmAb和抗CD80mAb ,分别阻断 4 1BB/ 4 1BBL和CD2 8/B7 1协同刺激信号。利用流式细胞术 (FCM)检测CD4 + T细胞、CD8+ T细胞的增殖率、CD8/CD4T细胞的比值变化和细胞分泌IFN γ的情况。结果 :用抗 4 1BBLmAb和抗CD80mAb阻断相应的协同刺激途径后 ,CD4 + 和CD8+ T细胞的增殖和细胞分泌IFN γ的水平均明显下降。培养 8d,抗CD3mAb单独刺激组CD8/CD4T细胞的比值为 1.98± 0 .0 6 ;抗 4 1BBLmAb阻断组CD8/CD4T细胞的比值下降为 0 .96±0 .0 3;而在抗CD80mAb阻断组 ,其比值上升为 2 .6 9± 0 .16。结论 :4 1BB分子可在CD4 + T细胞和CD8+ T细胞的活化、增殖中提供协同刺激信号。 4 1BB分子所介导的协同刺激信号 ,在CD8+ T细胞活化及增殖中发挥了更为重要的作用 ;而CD2 8分子所介导的协同刺激信号则更有利于CD4 +

4-1BBL分子在脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义

目的:探讨共刺激分子4-1BBL(CD137L)在胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法:免疫组化方法检测4-1BBL在82例脑胶质瘤组织中的表达,并分析其与病理分级、患者年龄、性别及生存时间的关系。结果:正常3例脑组织标本未见4-1BBL表达。82例胶质瘤标本31例4-1BBL阳性,阳性表达率为37.8%。统计学提示组织标本中4-1BBL表达与病理级别无明显相关性,与年龄有关(P<0.05),4-1BBL阳性患者生存期更长(P<0.05)。结论:4-1BBL在部分胶质瘤组织中有表达,其表达对判断胶质瘤患者的预后有一定的参考价值。

4-1BB(CD137)配体在几种肿瘤细胞株上的表达

目的 :研究 4 1BBL在几种人肿瘤细胞株上的表达。方法 :用RT PCR法检测肿瘤细胞内 4 1BBLmRNA水平的表达 ;用流式细胞仪检测肿瘤细胞膜表面 4 1BBL的表达。结果 :4 1BBL在Jurkat细胞株上高表达 (98.97% ) ,在HL 6 0和K5 6 2上表达较低 (分别为 2 4 .77%和 19.2 3% ) ,而在HT 2 9细胞株上基本不表达 (2 .13% )。结论 :4

共刺激分子4-1BB在强直性脊柱炎外周血淋巴细胞上的表达及其临床意义

目的探讨强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞共刺激分子4-1BB的表达及其临床意义。方法应用流式细胞术检测30例强直性脊柱炎患者及20例正常对照者淋巴细胞活化前后4-1BB蛋白的表达。结果强直性脊柱炎患者淋巴细胞活化前后4-1BB的表达明显高于正常对照组(P<0.01),而且其表达的4-1BB水平与免疫球蛋白IgA呈正相关关系。结论强直性脊柱炎患者淋巴细胞存在异常的4-1BB表达,这可能是导致强直性脊柱炎患者淋巴细胞活化和免疫反应发生的原因之一。

人4-1BB配体基因真核表达载体的构建、表达及其体外抗肿瘤效应

目的:构建人4-1BB配体(h4-1BBL)全长基因的真核表达载体,并在肿瘤细胞HT-29中转染表达;探讨人4-1BBL基因转染的肿瘤细胞体外诱导的抗肿瘤活性。方法:用RT-PCR从Raji细胞中克隆h4-1BBL全长基因,测序后,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-h4-1BBL。通过脂质体法以重组载体转染HT-29细胞,用RT-PCR检测转染细胞中h4-1BBLmRNA的表达;用流式细胞术检测转染细胞表面h4-1BBL分子的表达。分离外周血单个核细胞(PBMC),用抗CD3mAb扩增T细胞,并与h4-1BBL基因转染及未转染的HT-29细胞混合培养。用MTT比色法检测CTL的增殖及杀伤活性;用流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞。结果:从Raji细胞中克隆到h4-1BBL全长cDNA,测序完全正确。构建的h4-1BBL基因真核表达载体在HT-29中获得稳定表达。与未转染的细胞相比较,h4-1BBL基因转染的肿瘤细胞HT-29能更有效地刺激T细胞活化、增殖,促进IFN-γ分泌,并能有效地诱导CTL产生针对野生型HT-29细胞的特异性杀伤。结论:成功地构建pcDNA3.1(-)h4-1BBL重组真核表达载体。4-1BBL基因转染的肿瘤细胞介导的协同刺激信号,能增强野生型肿瘤细胞的免疫原性,诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答。

激发型4-1BB单抗联合凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞在恶性肿瘤免疫治疗中的作用

目的:研究激发型4-1BB单抗(2A)联合凋亡肿瘤细胞负载的DC(AP-DC)疫苗在小鼠B细胞淋巴瘤免疫治疗中的作用。方法:凋亡小鼠B细胞淋巴瘤细胞A20负载的DC用来制备AP-DC。A20荷瘤小鼠分别被注射AP-DC、2A单抗或二者联合。观察肿瘤生长情况及小鼠生存期。流式细胞术检测免疫治疗后荷瘤鼠脾脏T细胞的表型和胞浆内细胞因子;3H-TdR掺入试验检测T细胞体外增殖能力;ELISA法检测荷瘤鼠血清和脾脏T细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-10含量。结果:应用激发型4-1BB单抗2A或AP-DC疫苗对荷瘤小鼠开展免疫治疗,可抑制肿瘤生长,延长荷瘤鼠生存期,获得12.5%或25%的肿瘤完全缓解率。但二者联合应用,治疗效果更好,可获得62.5%的肿瘤完全缓解率,并且荷瘤鼠可长期生存。联合治疗后荷瘤鼠脾脏T细胞体外增殖更为显著,CD4+IFN-γ+T细胞的比例也明显增加。IL-2和IFN-γ的分泌水平在联合治疗荷瘤鼠的血清和脾脏T细胞的培养上清中升高更明显,而IL-10的分泌则降低。结论:激发型4-1BB单抗和AP-DC在肿瘤免疫治疗中有协同作用。

人4-1BB转基因细胞的构建及体外生物学功能的研究

目的构建人共刺激分子4-1BB转基因细胞并探讨4-1BB的体外生物学功能。方法利用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞总RNA中克隆出人4-1BB基因,经双酶切装入逆转录病毒载体pGEZ-Term中,重组逆转录病毒载体4-1BB/pGEZ-Term与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染重新铺板的293T细胞,加入Zeocin选择性培养基进行筛选。经RT-PCR、Western blot、流式细胞仪表型检测等方法鉴定转基因细胞;3H-TdR掺入法分析转基因细胞对T细胞的作用;DCs培养过程中,加入转基因细胞与激发型CD40单抗5C11,流式细胞仪分析DCs表面分子CD80、CD83和CD86的表达。结果成功构建了能稳定表达人4-1BB蛋白的转基因细胞4-1BB/293T,该转基因细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖,可协同5C11促进DCs的体外成熟,上调DCs表面分子CD80、CD83和CD86的表达。结论稳定表达4-1BB蛋白的转基因细胞株的建立为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。

小鼠髓系树突状细胞4-1BB及4-1BBL表达调节

探讨小鼠髓系树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)共刺激分子4-1BB及其配体4-1BBL表达的变化。将促DC成熟活化因子CD40L-CHO、TNF-α、LPS和IFN-γ,免疫负性调节因子IL-10以及各成熟活化因子与IL-10联合加入BMDC中,观察BMDC上4-1BB及4-1BBL表达的变化。结果显示,加入成熟活化因子的各组BMDC上4-1BB及4-1BBL表达与对照组相比有显著上调(P<0.05)。而IL-10组与对照组相比两者的表达显著下调(P<0.05),且各成熟活化因子与IL-10联合应用与单用IL-10组相比,BMDC上4-1BB和4-1BBL表达上调,有显著性差异(P<0.05)。提示成熟活化因子不仅能上调BMDC上4-1BB和4-1BBL的表达并且能有效拮抗mIL-10对BMDC上4-1BB和4-1BBL表达的下调作用。

4-1BB/4-1BBL在胃癌组织及其外周血中的表达及临床意义

目的探讨胃癌局部免疫与全身免疫状态。方法应用流式细胞术,测定胃癌患者癌组织及外周血中T淋巴细胞亚群、NK细胞水平,同时测定癌组织、癌周正常胃黏膜、淋巴结及外周血单个核细胞中4-1BB、4-1BBL含量。结果胃癌患者外周血中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值和NK细胞表达水平均显著高于胃癌组织(P<0.05),CD8+细胞计数反之(P<0.05)。4-1BB表达量由低到高的顺序为外周血单个核细胞、正常胃黏膜、淋巴结、癌组织、癌组织中单个核细胞;其中癌组织明显高于正常黏膜(P<0.05),有统计学意义;外周血单个核细胞中4-1BB表达量明显低于其他组织,有统计学意义(P<0.01)。癌组织中4-1BBL表达量低于正常黏膜,有统计学意义(P<0.05)。癌组织中4-1BB表达量与CD4+/CD8+比值、NK细胞表达水平呈负相关关系,4-1BBL与CD4+/CD8+比值、NK细胞表达水平呈正相关关系,有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌组织内免疫力低下,处于免疫抑制状态,胃癌组织的低免疫状态与4-1BBL缺乏有关;4-1BB与胃癌患者局部和全身的免疫状态亦有密切关系。总之,胃癌组织中4-1BB/4-1BBL的表达失衡与胃癌的免疫逃逸、低免疫状态有关。

急性动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血单核细胞4-1BB配体表达水平的变化

目的研究急性动脉粥样硬化性脑梗死(AC I)患者外周血单核细胞(PBMC)4-1BB配体(4-1BBL)表达水平的变化。方法通过流式细胞术和酶联免疫吸附分析(ELISA)测定20例ACI患者PBMC4-1BBL的表达和血浆可溶性4-1BBL(s4-1BBL)的浓度,并与19例动脉粥样硬化患者及23名健康对照者进行比较,并对部分患者做了连续观察。结果与正常对照组CD14+单核细胞上4-1BBL的阳性细胞率和平均荧光强度(MFI)[(4.6±2.4)%,(4.1±2.7)]和血浆s4-1BBL(75 pg/ml)比较,ACI组[(7.9±4.1)%,(7.0±4.0),133.2 pg/ml]显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),与动脉粥样硬化组阳性细胞率[(6.3±5.0)%]和MFI(5.2±2.3)和血浆s4-1BBL(84 pg/ml)比较差异均无统计学意义;在ACI恢复期4-1BBL的阳性细胞率和MFI分别为(7.6±5.4)%和(5.6±2.1),血浆s4-1BBL水平为113.2 pg/ml,与急性期相比呈下降趋势,但差异无统计学意义。结论 ACI患者4-1BBL的表达上调是ACI发病早期即被诱导产生的一个异常免疫应答,在动脉粥样硬化所致缺血性脑卒中的发病过程中可能发挥着重要的作用。

多发性硬化患者外周血CD4^+CD25^(high) T细胞上4-1BB和GITR的表达

目的:以往研究表明4-1BB和GITR均可表达于CD4+CD25+调节T细胞(regulatory T cell,Tr),在由该细胞群维持的自身耐受中起着重要作用。另有研究报道人外周血CD4+CD25highT细胞与该Tr的功能活性更为接近,且在多发性硬化(multiple sclerosis,MS)患者中的效应功能明显降低,但目前对其是否与上述两类分子的表达有关尚不清楚,因此我们检测了MS患者外周血CD4+CD25highT细胞上4-1BB、GITR的表达,旨在发现该调节T细胞群是否有上述分子的异常表达。方法:用流式细胞仪检测了未治疗MS、其他神经系统疾病患者、正常对照组外周血CD4+CD25highT细胞表面4-1BB、GITR的表达。结果:与正常对照比较,MS患者CD4+CD25highT细胞4-1BB的表达明显减少(P<0.05),而在CD4+CD25-T细胞的表达则与正常对照无明显差别(P>0.05)。三组间CD4+CD25highT细胞及其GITR的表达亦无显著差别(P>0.05)。结论:本研究发现MS患者CD4+CD25highT细胞上4-1BB的表达减少,而GITR的表达则较正常对照组则无显著差别,我们的结果提示该细胞群免疫活性的降低可能与其4-1BB的表达下调有关,而GITR则在CD4+CD25highT细胞的免疫调节过程中可能发挥着次要或精细调节的作用。

4-1BB/4-1BBL在自身免疫性心肌炎小鼠心肌中的表达及意义

目的:探讨4-1BB/4-1BBL在实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠心肌组织中的表达及意义。方法:将提纯的猪心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂等体积混合成乳浊液在1 d、8 d免疫具有遗传易感性的BALB/c小鼠,建立EAM模型。对照组小鼠仅用完全弗氏佐剂皮下注射。分别于初次免疫后21 d、80 d进行心肌炎症评分及血清cTnI测定,采用免疫荧光及RT-PCR技术检测4-1BB/4-1BBL在小鼠心肌组织中的表达。结果:在急性期21 d,模型组小鼠心肌组织见不同程度的急性炎性细胞浸润和心肌细胞变性坏死、cTnI水平高于对照组(P<0.05);80d模型组小鼠心肌组织炎症减弱伴有纤维化出现、cTnI较前期降低;免疫荧光见4-1BBL在模型组心肌中表达明显,在对照组小鼠心肌中少量表达(P<0.05);21 d模型组小鼠心肌组织中4-1BB/4-1BBL基因表达水平均高于对照组(P<0.01),80 d时表达仍然升高(P<0.01)。结论:4-1BB/4-1BBL在EAM小鼠心肌中的表达是上调的,4-1BB/4-1BBL通路参与了自身免疫性心肌炎的发生发展过程。

维甲酸相关核孤儿受体γt和4-1BB/4-1BBL在口腔扁平苔藓中的表达及意义

目的研究口腔扁平苔藓(OLP)患者外周血中维甲酸相关核孤儿受体γ(tRORγt)和4-1BB/4-1BBL mRNA的表达。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测30例OLP患者和30例健康人外周血中RORγt和4-1BB/4-1BBL的基因表达水平。结果在OLP患者中,RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05),结果经2-ΔΔCT转换后,OLP组3种基因mRNA表达水平分别是健康对照组的3.087、3.320和4.005倍。RORγt和4-1BB mRNA的表达水平无明显相关性(P>0.05),4-1BB和4-1BBL mRNA表达水平呈正相关(r=0.455 0,P<0.05)。结论RORγt和4-1BB/4-1BBL在OLP的发病中起了一定作用。

4-1BB体外刺激的T淋巴细胞抑制小鼠黑色素瘤的作用

目的:探讨4-1BB体外刺激下小鼠T淋巴细胞的增殖情况及对小鼠黑色素瘤的抑瘤效果.方法:在IL-2+CD3+CD28基础上,增加4-1BB为刺激条件,体外培养经诱导的小鼠腹股沟淋巴结T细胞,MTT法检测其体外增殖率,并建立小鼠黑色素瘤实验模型,观察所诱导T淋巴细胞的抑瘤效果.结果:增加4-1BB后,T淋巴细胞的增殖率明显增加[(1.15±0.08)%vs(0.57±0.06)%,P<0.01],将所诱导的T淋巴细胞注入小鼠模型,其肺转移灶数目明显减少[(93±16)vs(151±22),P<0.01],生存率提高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:4-1BB在体外可促进T淋巴细胞的增殖,并具有较强的抗黑色素瘤作用.

小鼠髓系树突状细胞上4-1BB分子的功能性表达

目的 探讨小鼠髓系DC(CD8α-)中4-1BB的功能性表达。方法 采用免疫荧光标记和流式细胞仪检测DC上4-1BB分子的表达,用酶联免疫方法检测DC分泌的IL-2和IL-12。结果 小鼠髓系DC前体细胞中已有4-1BB分子表达,且随着DC的分化发育和成熟,其表达上调。激发型抗4-1BB分子的抗体2A刺激的DC分泌IL-2和IL-12能力增强,而2A抗体联合TNF-α刺激的DC分泌IL-2和IL-12的量明显高于两者单独刺激组(P<0.05)。结论 小鼠髓系DC表达的4-1BB具有功能性。