CM-Dil与DAPI联合标记人羊膜上皮细胞的可行性研究

目的建立人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cell，HAEC）的体外培养方法，并探讨氯甲基苯甲酰胺（CM—Dil）与4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对HAEC进行联合标记示踪的可行性。方法运用酶消化法获取HAEC，收集第2代细胞，流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CIM5和CD105的表达率，SP免疫化学法鉴定HAEC。CM—Dil与DAPI对HAEC进行体外标记，荧光倒置显微镜下观察1d、7d和14d的标记情况，台盼蓝染色检测细胞活力，CCK-8法检测细胞增殖以明确联合标记对体外培养HAEC生长特性的影响。结果HAEC贴壁培养后呈扁平多角形，CD29、CD34、CD44、CD45和CD105的阳性率分别为99．64％、2．21％、32．41％、0．84％、36．70％，细胞角蛋白Keratin阳性表达。HAEC在cM—Dil和DAPI联合标记1d后，荧光显微镜下可观察到细胞膜和细胞核分别在不同波长下呈红色和蓝色荧光，标记率为100％；14d后，经传代培养的HAEC荧光强度与1d时相近，细胞形态无改变。台盼蓝染色显示标记细胞存活率为96．8％-98．9％，CCK-8检测标记细胞的增殖力较未标记组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论CM—Dil和DAPI可有效标记HAEC，染色简单、无细胞毒性，荧光衰减较慢，可作为HAEC的标记及示踪方法。

Notch信号通路在血小板衍生生长因子-BB诱导人胰腺癌细胞增殖过程中的作用

目的探讨Notch信号通路在血小板衍生生长因子(PDGF)-BB诱导人胰腺癌细胞(HPAC)增殖过程中的作用。方法 MTT法检测PDGF-BB及γ-secretase抑制剂4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPT)对HPAC增殖活力的影响;Western blotting检测细胞Notch蛋白表达水平的变化;染色质免疫共沉淀(CHIP)检测Notch下游靶基因转录水平的变化。结果 PDGF-BB显著促进HPAC增殖,提高细胞Notch表达水平,增强Notch靶基因的转录;不同剂量的DAPT及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂处理细胞,显著反转了PDGF-BB的作用。结论 Notch信号通路在PDGF-BB诱导胰腺癌细胞增殖中起到重要作用。

中耳胆脂瘤中DAPI核染色、FOXO3和Bim的表达和意义

目的检测中耳胆脂瘤中人类叉头框O3(forkhead box O3,FOXO3)、唯BH3域蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)的表达和相关性,以及Bim和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色的相关性,探讨FOXO3和Bim在中耳胆脂瘤中的作用。方法应用免疫组化染色(immunohistochemistry)检测30例中耳胆脂瘤标本及15例正常皮肤中FOXO3、Bim的表达和定位;通过免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)检测这些标本中Bim和DAPI的染色情况;应用Western blot检测以上标本FOXO3、Bim及内参的表达情况;分析Bim和DAPI核染色的相关性、Bim和FOXO3表达的相关性。结果①免疫组化染色显示,FOXO3在胆脂瘤和正常皮肤的细胞核及胞质均有着色,在胆脂瘤细胞核中FOXO3的阳性样本率(36.7%,11/30)明显低于正常皮肤(86.7%,13/15)(χ^(2)=10.04,P<0.05);胆脂瘤细胞胞质中FOXO3的阳性率(30.0%,10/30)也显明低于正常皮肤(80.0%,12/15)(χ^(2)=8.72,P<0.05)。Bim主要定位于胆脂瘤和正常皮肤的细胞质,其在胆脂瘤中的阳性率(53.3%,16/30)明显低于正常皮肤组织(93.3%,14/15)(χ^(2)=7.20,P<0.05)。②免疫荧光染色显示DAPI和Bim在胆脂瘤的荧光值(分别为25.37±3.67和35.16±4.21)均弱于正常皮肤(分别为91.45±10.14和82.51±7.34),差异有统计学意义(t=1.93,P<0.05;t=1.71,P<0.05)。③Western blot检测显示胆脂瘤中FOXO3和Bim的表达均明显低于正常皮肤,差异具有统计学意义(t=2.01,P<0.05;t=1.99,P<0.05)。④在中耳胆脂瘤标本中,FOXO3和Bim呈正相关(r=0.362,P<0.05);Bim和DAPI呈显著正相关(r=0.501,P<0.01)。结论FOXO3/Bim信号通路在中耳胆脂瘤的形成过程中发挥了作用,且该作用与抗凋亡有关。

Ki67与核酸荧光共染在细胞周期研究中的应用

病原微生物与宿主细胞的相互作用是感染过程中的一个重要环节,也是研究肿瘤生物学的一项重要内容。动态研究细胞周期变化对了解病原体作用于细胞具有重要意义。本研究用Ki67/4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)和Ki67/碘化丙啶(propidium iodide,PI)共染技术分析了小鼠脾细胞的细胞周期变化,并介绍其具体应用。

贝类生态综合养殖系统中细菌丰度的变化

2011年4—10月在福建云霄,对以贝类为主的生态综合养殖系统内的藻类池(A池)和贝类池(B池)逐月采样检测,并分析两池水体及B池沉积物中细菌丰度的时空变化规律.结果发现:水体中细菌丰度,B池为1.01×106～4.35×106 cell/mL;A池为1.09×106～6.61×106 cell/mL.A池和B池水体中细菌丰度没有明显的月变化规律,但昼夜变化明显.B池水体中细菌丰度与叶绿素a、总氮、总磷、温度和盐度的关系4—7月呈明显的正相关(r=0.984,n=4);8月细菌丰度急剧下降,因采样期间有连续降雨,细菌丰度变化和降雨可能有一定的关系.A池水体中细菌丰度与叶绿素a呈显著负相关(r=-0.821,n=7),与温度呈显著负相关(r=-0.830,n=7),温度不是影响A池细菌增殖的主要因子.B池底泥样品中细菌丰度比水体中的低,主要可能是水交换和养殖贝类活动共同作用的结果.采样期间发现,在阴雨天气时池塘水面会有泡沫漂浮,细菌丰度高于其所在水体达2.25×107cell/mL,其作用机制有待于进一步研究.

果蔬垃圾堆肥过程中原核生物和真菌的气溶胶化能力

1研究亮点*分析了果蔬垃圾堆肥过程中细菌、古菌和真菌主要种属的优先气溶胶化能力;*低丰度微生物,例如,奇古菌(Thaumarchaeota)也能够优先气溶胶化;*气溶胶化微生物中,致病性微生物属的占比超过90%。2背景微生物气溶胶是指存在于气相介质中由微生物(包括细菌、古菌和真菌等)、微生物细胞碎片和产物组成的分散体系。研究结果表明,气溶胶中的微生物及其产物会对人体造成器官特异性和系统性的健康危害。例如,放线菌、黄曲霉、烟曲霉、赭曲霉毒素、炭疽杆菌、镰刀菌、肺炎链球菌和内毒素等会造成呼吸道感染、炎症和哮喘等健康问题。

羽衣甘蓝小孢子胚胎发生观察及再生植株倍性鉴定

以5个不同基因型羽衣甘蓝品种为试材进行游离小孢子培养,研究小孢子发育时期与花蕾形态的关系、基因型对小孢子出胚率的影响、胚成苗及再生植株加倍和倍性鉴定。结果表明:(1)适宜于羽衣甘蓝游离小孢子培养的花蕾形态指标为:蕾长3.5～4.5mm、花瓣/花药为0.85～1.10。(2)在5个供试品种中,‘4105’出胚率最高,每蕾2.45个,其次是‘7341’,每蕾2.18个,‘7340’和‘7348’小孢子出胚情况较差,分别为每蕾1.36和0.51个,而‘7342’没有出胚。(3)采用150mg.L-1秋水仙碱浸泡幼苗根部24h,结合流式细胞仪快速检测植株倍性,发现二倍体总加倍率为78.4%,大大提高了小孢子再生植株的利用效率。

实验室条件下长角血蜱胚胎发育过程

目的在实验室条件下观察两性和孤雌生殖方式长角血蜱的胚胎发育过程,为该种群数量动态预测和控制提供依据。方法在温度为(26±1)℃,相对湿度为(75±5)%,光周期(L∶D)为16 h∶8 h条件下,应用胚胎固定和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色技术对长角血蜱胚胎发育过程进行观察描述。组间差异比较采用独立样本t检验。结果孤雌生殖长角血蜱胚胎发育历期[(24.6±1.7)d]显著长于两性生殖长角血蜱[(22.5±3.5)d](t=2.699,P=0.010)。两种生殖种群胚胎发育过程无明显差异。胚胎发育过程大致分为:发育1 d,初期胚胎能够识别到细胞核;发育4 d,细胞数量显著增加,胚盘出现;发育6 d,胚胎体节和腹侧沟出现;发育7 d,能够明显区分出头部、胸部、生长区,3对附肢(1L~3L)原基清晰,第4附肢(4L)明显短于前3对附肢,发育12 d,腹侧沟关闭,第4附肢开始退化,另外3对附肢变大,胚胎收缩到前腹区,背侧开始闭合;发育16 d,背侧闭合继续发生,头部的螯肢定位发生改变;发育20 d,背侧闭合完成,胚胎开始孵化。结论明确了长角血蜱胚胎在实验室条件下的发育过程,为该蜱数量动态的预测和控制提供了依据。

移植途径对大鼠骨髓间充质干细胞归巢及肝功能恢复的影响

目的探讨移植途径对骨髓间充质干细胞(MSCs)归巢及促进肝切除大鼠肝再生的影响。方法建立肝切除大鼠模型,随机分为3组,即肝切除对照组、尾静脉移植组和门静脉移植组。移植组分别经尾静脉和门静脉注射DAPI标记的MSCs约1.5×106/只,分别于第3天和第9天后采血清检测肝功能,第9天处死大鼠取肝脏标本,并通过荧光显微镜观察两种移植途径对MSCs向肝脏迁移的影响。结果门静脉移植组(18.1±3.4)个细胞/100倍视野到肝脏归巢及定植的MSCs多于尾静脉移植组(7.6±2.0)个细胞/100倍视野,差异有统计学意义(P<0.01)。术后第9天各组大鼠肝功能均有好转,丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)3组之间对比差异无统计学意义(F=2.822,1.046,P=0.057,0.365,P>0.05);但两移植组与单纯肝切除组比较血浆白蛋白(ALB)均有明显升高,差异具有统计学意义(F=6.259,P=0.006);尾静脉移植组与门静脉移植组两移植组之间相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论移植途径对MSCs归巢、定植到肝脏有一定影响,门静脉途径优于外周静脉,MSCs移植对肝大部切除大鼠肝功能恢复具有促进作用。

冬虫夏草、蛹虫草菌丝隔膜和细胞核荧光染色

冬虫夏草和蛹虫草作为重要的药用真菌,得到广泛的重视,迄今已有大量的研究报道。然而,作为细胞学研究的基础处理方法,其菌丝隔膜和细胞核染色却缺乏必要的研究。荧光染色是一种程序简便、快速灵敏的染色方法。本研究选用DAPI、PI、Calcoflour White和刚果红等4种染料,对冬虫夏草、蛹虫草菌丝的隔膜和细胞核进行单独与组合染色实验,通过显微观察比较得出较好的染色方法。结果表明DAPI对冬虫夏草和蛹虫草菌丝的细胞核染色效果都较好,而Calcoflour White对两者的细胞壁染色效果较好且隔膜清晰。DAPI与Calcoflour White两者进行冬虫夏草菌丝组合染色的效果为最佳,但在蛹虫草菌丝染色中效果不太稳定。对蛹虫草菌丝较好的组合染色是DAPI与刚果红的组合,但其染色结果需要在激光共聚焦显微镜下观察。

多聚磷酸盐:菌体内多功能调控子和环境压力守护者

多聚磷酸盐(polyP)是由几个到上百个磷酸基团组成并由高能磷酸酐键连接的链状无机化合物,广泛地存在于所有生命体中。研究表明,polyP在不适宜的生存条件下会在菌体内聚集,使菌对环境压力有极强的耐受性,它与其相关的酶PPK、PPX、ppp Gpp等一起作出应激反应;在寡营养环境下,polyP作为能量和磷源库,和Rpo S、Lon蛋白及σ因子等一起参与一系列饥饿压力应答,这种存活机制与寡营养菌的生活方式类似。这些反应得益于polyP链状的灵活性和高荷电性,但是其具体的调控机理仍很少为人所知。本文阐述了以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole,DAPI)为基础的荧光染色方法进行菌体内polyP的定性(荧光或电子显微镜)和定量(荧光分光光度计),重点归纳分析了以polyP为核心的关于细菌适应恶劣生存环境的代替机制。

骨髓间充质干细胞在移植肝中的定居

目的 观察骨髓间充质干细胞（BMSCs）在移植肝中的定居.方法 通过密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,应用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原（CD45、CD44、CD90）的表达,分别用0.5、1.5、2.5 mg/L浓度的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对间充质干细胞标记12h,在荧光显微镜下观察细胞标记情况,用最佳标记浓度标记的细胞在肝移植门静脉套管前注入移植肝中,分别在7、12d取冰冻病理标本,在荧光显微镜下观察间充质干细胞的定居情况.结果 密度梯度离心法成功分离培养出间充质干细胞,流式细胞仪鉴定结果显示CD90、CD44、CD45阳性表达率分别为97.1％、87.4％、1.1％.3种浓度的DAPI均能标记间充质干细胞,其中1.5 mg/L标记率最高,达95％.移植术后7、12 d的病理标本中均能观察到荧光.结论 BMSCs能够成功定居在肝移植术后的肝脏中.