低温β-1,4-内切葡聚糖酶的基因挖掘、异源表达及其酶学性质表征

β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,并将其在大肠杆菌中实现了可溶性表达,其中大部分存在于周质空间,少部分分泌至胞外。对EgDC酶的酶学性质进行了表征,发现该酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和pH 6.5,其在20℃能保持70%以上活力,且在pH 8.0和pH 9.0的半衰期分别达到83.43 min和53.79 min。EgDC酶具有较好的催化性质,其比酶活力k_(cat)/K_(m)值分别为(26.38±1.43)U/mg和(520.03±17.07)s^(-1)/mg,且对于金属离子以及表面活性剂均具有较强耐受能力。由此可见,新型β-1,4-内切葡聚糖酶EgDC具有较好的催化能力,且在低温、碱性以及存在表面活性剂环境下较为稳定,因此具有潜在的工业应用价值。

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。

黑曲霉内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0。

阴沟肠杆菌一个内切纤维素酶Cel8A的克隆和功能证实

【目的】为了解决纤维素的酶水解问题,分析能水解纤维素的微生物的相关基因。【方法】从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的基因组数据中挖掘纤维素酶相关基因,发现开放读码框Cel8A和纤维素酶基因序列具有高相似性。利用重组表达技术在大肠杆菌中对Cel8A基因进行表达,纯化重组蛋白质并对该蛋白质进行功能鉴定。【结果】Cel8A蛋白质能水解羧甲基纤维素钠,它具有β-1,4-内切葡聚糖酶的水解特性。Cel8A的最适反应pH值为7.0,最适温度为40℃。【结论】成功克隆表达阴沟肠杆菌的Cel8A基因,并证实该基因编码的蛋白质具有β-1,4-内切葡聚糖酶活性,为进一步研究阴沟肠杆菌的纤维素酶组成以及纤维素降解机理奠定了基础。

中华绒螯蟹内源性纤维素酶EsGH9-1基因的克隆、表达及其对不同饵料的响应

本研究从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)转录组数据库中比对筛选到内源性纤维素酶(β-1,4-内切葡聚糖酶)基因序列信息,通过克隆获得该纤维素酶(EsGH9-1)基因组DNA和c DNA序列。EsGH9-1基因组DNA序列长度为11 679 bp,包含15个外显子和14个内含子;c DNA序列全长为2044 bp,编码580个氨基酸,具有糖基水解酶第9家族的典型催化功能域。RT-PCR结果显示,EsGH9-1主要分布在肝胰腺组织,在大眼幼体期和仔蟹早期高表达。不同饵料条件下,EsGH9-1相对表达量在植物性饵料组显著上调,与β-1,4内切葡聚糖酶活性趋势相一致,推测EsGH9-1参与纤维素的消化与分解。本研究证明中华绒螯蟹自身具有纤维素酶基因,为今后深入研究内源性纤维素酶在水生甲壳类的摄食与消化机制中的作用奠定了基础。

小麦蓝矮病植原体FrvX基因的克隆及致病性测定

【目的】克隆小麦蓝矮病(WBD)植原体β-1,4-内切葡聚糖酶基因(FrvX),验证其在植原体侵染寄主中的作用,为更好地防控小麦蓝矮病奠定理论基础。【方法】采用PCR技术从小麦WBD植原体中扩增到FrvX全基因,将其插入到病毒载体pgR107中,构建重组病毒载体pgR107-FrvX,用农杆菌介导法侵染本氏烟草,观察烟草表型的变化。【结果】FrvX基因全长1071bp,编码356个氨基酸。重组病毒载体接种烟草22d后,有9株烟草植株表现出明显的花叶、黄化症状,RT-PCR检测到发病植株接种7d后的叶片有FrvX基因的转录。【结论】FrvX基因接种烟草导致烟草表型发生变化,推测其与植原体病害的发生有关。