β-1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ在大鼠坐骨神经髓鞘中的表达

目的 :分析β -1,4半乳糖基转移酶 -Ⅰ(β -1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -Ⅰ)mRNA在正常和损伤坐骨神经髓鞘上的定位及其表达变化。方法 :首先采用RT -PCR方法 ,分析 β -1,4-GalT -Ⅰ在小鼠坐骨神经中的表达存在。以RT -PCR扩增的DNA片断 ,将其克隆到pGEM -T载体中。采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义 β -1,4-GalT -ⅠRNA探针。最后通过原位杂交及图像分析的方法 ,分析 β -1,4-GalT -ⅠmRNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的定位及其表达变化。 结果 :首先通过RT -PCR方法 ,检测到 β -1,4-GalT -Ⅰ在小鼠坐骨神经中的表达存在。应用地高辛标记的正、反义β -1,4-GalT -ⅠRNA探针 ,通过原位杂交发现 β -1,4-GalT -Ⅰ在大鼠坐骨神经的髓鞘中表达 ,并发现其在坐骨神经损伤后 2～ 3天内表达最高 ,随后表达下降。结论 :本实验发现 β -1,4-GalT -Ⅰ在坐骨神经主要表达在髓鞘中 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。这样把 β -1,4-GalT -Ⅰ的修饰调控功能和雪旺氏细胞的功能相联系在一起 ,为进一步分析β -1,4-GalT

β1,4-半乳糖基转移酶1对气道平滑肌细胞炎症反应的影响

为了探究β1,4-半乳糖基转移酶1(β4GalT1)在气道平滑肌细胞中的功能,通过高通量基因表达数据库(GEO)分析β4GalT1在气道平滑肌细胞炎症反应存在功能,采用脂多糖刺激气道平滑肌细胞后检测白介素1β及β4GalT1的表达;采用慢病毒包装构建过表达β4GalT1的稳转细胞,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测稳转细胞中炎症相关细胞因子表达随时间的变化,同时通过细胞增殖实验、细胞周期和划痕实验检测稳转细胞的生物学行为变化,研究过表达β4GalT1的细胞分泌液在调节细胞因子表达过程中的作用。结果表明:脂多糖能引起白介素1β及β4GalT1的表达量增加;随着培养时间的延长,过表达β4GalT1的细胞中促炎因子表达量减小,抑炎因子表达量增加,同时过表达β4GalT1可改变气道平滑肌细胞的增殖、迁移行为,进而起到炎症修复功能;过表达β4GalT1的细胞可通过分泌液调节细胞因子的表达,表明β4GalT1能快速响应对气道平滑肌细胞的炎症刺激,并通过分泌物质调节气道平滑肌细胞的细胞行为及细胞因子变化。

微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基转移酶1增强肺腺癌细胞的放疗敏感性的研究

目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在肺腺癌中的表达及临床意义,分析miR-148a-3p靶向蛋白核心1β13-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)对肺腺癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法选取肺腺癌组织芯片中76例患者肿瘤组织及肺腺癌A549细胞株为研究对象。对组织芯片分别进行miR-148a-3p原位杂交(ISH)染色和C1GALT1免疫组织化学染色,分析76例肺腺癌患者肿瘤组织中miR-148a-3p的表达与临床病理、预后及C1GALT1表达的关系。采用细胞转染技术对A549细胞进行miR-148a-3p过表达质粒的转染;转染细胞接受2 Gy放疗后采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性;采用蛋白质印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与C1GALT1的靶向调控关系;采用共转染技术分析miR-148a-3p调控A549细胞放疗敏感性的机制。结果76例肺腺癌组织中低表达miR-148a-3p与患者淋巴结转移显著相关(P=0.012);miR-148a-3p高表达者预后显著优于miR-148a-3p低表达者(P=0.005);肺腺癌组织中miR-148a-3p与C1GALT1的表达呈显著负相关(P=0.023)。多因素分析显示,miR-148a-3p低表达、T分期及淋巴结转移是预后的独立危险因素。克隆形成实验显示,过表达miR-148a-3p组克隆形成数显著低于对照组(P<0.001);Western Blot结果显示,miR-148a-3p过表达可以显著下调细胞中C1GALT1蛋白水平(P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-148a-3p通过结合C1GALT1的3′UTR来调控C1GALT1的表达。功能拯救试验显示C1GALT1能够部分抵消miR-148a-3p的放疗增敏效应。结论肺腺癌中miR-148a-3p低表达与淋巴结转移、C1GALT1高表达及预后不良显著相关,miR-148a-3p通过负调控C1GALT1的表达增强肺腺癌细胞的放疗敏感性。

β-1,3-半乳糖基转移酶2对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制

目的探讨β-1,3-半乳糖基转移酶2(B3galt2)对脑缺血损伤模型小鼠脑损伤的作用及其机制。方法将成年雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型组、MCAO模型+慢病毒载体对照组(LV-GFP组)、MCAO模型+慢病毒载体过表达B3galt2组(LV-B3galt2组),每组6只。各组小鼠于脑缺血24 h后进行神经功能缺损评分和旋转棒实验,采用2,3,5-三氨基苯甲四氮唑染色测定脑梗死体积,采用尼氏染色法观察各组小鼠脑缺血半影区神经元数量,检测各组小鼠脑组织中氧化应激相关因子水平。结果与Sham组比较,MCAO模型组小鼠脑梗死体积增大,神经功能缺损明显(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显减少,活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平明显升高(均P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平明显降低(均P<0.05);与MCAO模型组比较,LV-B3galt2组小鼠脑梗死体积减小,神经功能明显改善(P<0.05),脑缺血区神经元数量明显增加,ROS和MDA水平明显降低(均P<0.05),SOD和GSH水平明显升高(均P<0.05)。结论B3galt2过表达可以减轻脑缺血损伤模型小鼠脑损伤,其作用机制可能是通过抑制氧化应激反应实现的。

β-1,3半乳糖基转移酶-1和β-1,3半乳糖基转移酶-2在乳腺癌中的表达及临床意义

目的检测β-1,3半乳糖基转移酶-1(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT1)和β-1,3半乳糖基转移酶-2(β-1,3-galactosyltransferase-1,B3GALT2)在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系,并分析其相关通路。方法选取乳腺癌及癌旁组织标本132例,采用Western Blot法和免疫组化方法检测B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达,分析其临床意义。通过基因集富集分析法探索相关通路。结果乳腺癌组织中B3GALT1和B3GALT2表达均低于癌旁正常组织(P<0.05),二者表达呈正相关(r=0.635,P<0.001),且两者表达阳性患者与阴性患者的T分期和Ki-67比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。B3GALT1和B3GALT2均富集于JAK-STAT通路和Notch通路。结论B3GALT1和B3GALT2在乳腺癌中低表达,与乳腺癌的增殖、生长密切相关。

β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ对施万细胞增殖的影响

目的 探讨周围神经施万细胞表达 β1,4 半乳糖基转移酶 Ⅰ (β 1,4 GalT Ⅰ )对其增殖的影响。 方法 将构建的正、反义 β 1,4 GalT Ⅰ表达质粒 ,转染到施万细胞中 ,分析转染细胞倍增时间、3H TdR掺入情况以及细胞周期变化。 结果 转染正义β 1,4 GalT Ⅰ后施万细胞的增殖受到抑制 ,这种作用随转染浓度增大而增强 ;在G1 /G0 期的细胞数目增加 ,S期的数目减少。而转染反义 β 1,4 GalT Ⅰ有相反的作用。 结论 β 1,4 GalT Ⅰ对施万细胞的增殖有抑制作用 ,可能在周围神经施万细胞的增殖调节中发挥重要作用。

细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在免疫突触形成中的作用

目的:研究细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-I)在免疫突触形成中的作用。方法:以抗CD3、CD28单克隆抗体活化Jurkat细胞,应用实时荧光定量PCR及流式细胞术检测分析β-1,4-GalT-I的表达变化,激光共聚焦显微镜观察β-1,4-GalT-I在Jurkat细胞活化前后的表达与定位;将Jurkat细胞与SEB负载的Raji细胞共培养以构建Jurkat-Raji细胞免疫突触,观察β-1,4-GalT-I在免疫突触中的定位。结果:β-1,4-GalT-I mRNA表达水平随着Jurkat细胞的活化逐渐增高,在细胞活化后36小时达到高峰;活化后细胞表面β-1,4-GalT-I分子的表达较静止状态高;共聚焦显微镜显示在活化的Jurkat细胞表面及Jurkat-Raji细胞免疫突触部位β-1,4-GalT-I表达信号增强且其分布发生重排和簇集,且与CD3分子共定位,与CD28分子部分共定位。结论:Jurkat细胞表面的β-1,4-GalT-I分子参与了免疫突触的形成。

β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在树突状细胞中的表达及作用

目的:观察β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ)在人外周血来源的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)中的表达与定位,研究其对DCs免疫功能的影响。方法:人外周血单核细胞经GM-CSF+IL-4+TNF-α诱导培养分化为DCs,采用RT-PCR、流式细胞术和激光共聚焦技术观察DCs中β-1,4-GalT-Ⅰ的表达与定位;通过细胞粘附试验分析β-1,4-GalT-Ⅰ表达与细胞粘附能力的关系。用α-乳清蛋白(α-lactalbumin,LA)作为细胞表面β-1,4-GalT-Ⅰ抑制剂,研究β-1,4-GalT-Ⅰ在DCs细胞粘附以及与CD4+Th细胞形成免疫突触过程中的作用。结果:在人外周血来源DCs细胞表面和细胞浆内可表达长型和短型β-1,4-GalT-Ⅰ;长型β-1,4-GalT-Ⅰ或细胞表面β-1,4-GalT-Ⅰ的表达水平与细胞粘附能力呈正相关;α-LA既可抑制DCs对层粘连蛋白的粘附,又可抑制DCs与CD4+Th形成免疫突触。结论:β-1,4-GalT-Ⅰ在DCs中表达,他们作为粘附分子参与细胞粘附和免疫突触形成。

PKC在TNF-α诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ表达中的作用

目的：研究蛋白激酶C（PKC）对肿瘤坏死因子-α（TNF—α）诱导内皮细胞β-1，4-半乳糖基转移酶-I（β-1，4．GaIT—I）表达的调节作用，以及对内皮细胞骨架结构改变及其黏附能力的影响。方法：分别用PKC激动剂或几种不同类型的PKC抑制剂预处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），再用TNF一仅刺激HUVECs，应用RT—PCR、Western blot方法检测B．1，4-GaIT—I表达变化，应用细胞荧光染色观察B-1，4-GalT—I催化的糖链的表达变化及细胞骨架结构的改变，通过内皮-单核细胞黏附试验观察HUVECs黏附能力的改变。结果：几种不同类型的PKC抑制剂均能不同程度的抑制TNF-α刺激HUVECs引起的β-1，4-GaIT—I表达的上调，PKC激动剂能够使上调的β-1，4-GaIT—I的表达进一步增加；在HUVECs中β-1，4-GaIT—I与细胞骨架有共同定位，PKC抑制剂显著抑制TNF—α诱导的内皮细胞骨架蛋白的重构和β-1，4-GaIT—I细胞内的再分布；PKC抑制剂显著抑制TNF—α诱导的内皮一单核细胞黏附能力的上调。结论：PKC可能参与调节TNF—α诱导的HUVECsβ—1，4-GaIT—I的表达，并且可能多种类型的PKC参与了这一调节过程；PKC可能通过对β-1，4-GaIT—I的调节进而影响炎症过程中内皮细胞骨架蛋白的重构及内皮细胞与单核细胞的黏附能力。

细胞外信号调节激酶在脂多糖诱导内皮细胞β-1，4-半乳糖基转移酶-Ⅰ表达中的作用

目的:研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ)表达的调节作用。方法:应用ERK通路抑制剂U0126预处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)2 h,再用LPS刺激HUVECs 4 h,分别用RT-PCR和Western-blot方法检测β-1,4-GalT-ⅠmRNA及蛋白水平表达变化,并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HUVECs黏附能力的改变。结果:U0126显著抑制LPS引起的HUVECsβ-1,4-GalT-Ⅰ表达的上调及其黏附能力的上词。结论:ERK信号转导通路可能参与调节LPS诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-Ⅰ的表达,并影响内皮细胞的黏附能力。

β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在大鼠脑损伤后的表达分析

目的 :探讨脑损伤后β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ)及其催化合成的β-1,4-半乳糖苷键(β-1,4-galactosylated carbohydrate,Galβ1-4GlcNAc)糖链与炎症的相关性。方法:运用免疫印迹法检测β-1,4-GalT-Ⅰ及Galβ1-4GlcNAc糖链在大鼠术后大脑皮质中的表达情况;采用免疫荧光双标,观察β-1,4-GalT-Ⅰ及Galβ1-4GlcNAc糖链在大脑皮质中的细胞定位。结果:大鼠脑损伤后,大脑皮质中β-1,4-GalT-Ⅰ及Galβ1-4GlcNAc糖链的表达水平呈现时间依赖关系,脑损伤后β-1,4-GalT-Ⅰ表达逐渐增加并持续在较高的水平,Galβ1-4GlcNAc糖链表达呈动态变化过程,在炎症早期上调达到高峰后有所降低。β-1,4-GalT-Ⅰ及其催化合成的Galβ1-4GlcNAc糖链主要定位于大脑皮质的活化的小胶质细胞中。结论:β-1,4-GalT-Ⅰ及其催化合成的Galβ1-4GlcNAc糖链在正常大脑皮质中仅有少量表达,脑损伤后两者表达均明显增高;术后高表达的β-1,4-GalT-Ⅰ主要定位于小胶质细胞,这提示该分子可能参与炎症介导的小胶质细胞的生物学行为的改变。

β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在先天性巨结肠的表达及意义

目的 观察β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ（β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ）基因B4GALT1和蛋白在先天性巨结肠（HD）中的表达及其催化合成的β-1,4-半乳糖苷键（β-1,4-galactosylated carbohydrate,Galβ1-4GlcNAc）糖链在HD中的表达和分布,探讨它们与HD的发病关系及其意义.方法 运用RT-PCR和Western blot技术检测37例HD患儿狭窄段（无神经节细胞段）、移行段、正常段结肠肠壁组织和6例对照组肠套患儿中B4GALT1 mRNA和β-1,4-GalT-Ⅰ蛋白的表达,计算其相对量并进行比较分析.采用免疫组织化学方法观察肠壁内各层之间β-1,4-半乳糖苷键（利用特异性识别β-1,4-半乳糖苷键的蓖麻凝集素）的分布情况.结果 RT-PCR和Western blot结果显示B4GALT1基因及β-1,4-GalT-Ⅰ蛋白在狭窄段表达明显增高,从狭窄段到正常段逐渐减低,差异有统计学意义（P〈0.05）,HD扩张段和对照组肠段表达差异无统计学意义;免疫组化结果显示,特异识别β-1,4-半乳糖苷键糖链结构的蓖麻凝集素（RCA-Ⅰ）染色面积及染色强度从狭窄段到正常段依次减弱,差异有统计学意义（P〈0.05）,同样HD扩张段和对照组肠段RCA-Ⅰ的表达差异无统计学意义,两者呈正相关.结论 β-1,4-GalT-Ⅰ在HD狭窄段（无神经节细胞段）表达增高是内在的,它与HD的发生可能存在某种内在的联系.

雪旺氏细胞表达β-1,4半乳糖基转移酶-I对神经元轴突生长的影响

为了探讨周围神经雪旺氏细胞中不同 β -1,4半乳糖基转移酶 -I(β -1,4-galactosyltransferaseI ,β -1,4-GalT -I)表达水平对神经元轴突生长的影响 ,本实验首先构建了正、反义 β -1,4-GalT -I表达质粒 ;然后将构建的不同浓度的正、反义表达质粒超表达于分离、纯化的大鼠雪旺氏细胞 ;最后将转染的雪旺氏细胞与分离的大鼠背根神经节共培养 ,根据共培养神经元轴突延伸的数目和面积 ,分析雪旺氏细胞中不同 β -1,4-GalT -I表达水平对神经元轴突生长的影响。结果发现 :转染正义 β -1,4-GalT -I的雪旺氏细胞能促进共培养神经节轴突的长出和延伸。在一定的转染浓度内 ,这种促神经生长作用随转染浓度增大而增强 ,而转染反义 β-1,4-GalT -I却有相反的作用。提示周围神经雪旺氏细胞中表达 β -1,4-GalT

β-1,4半乳糖基转移酶-I在大鼠坐骨神经损伤后的表达变化

目的 分析 β 1,4半乳糖基转移酶 I (β 1,4 galactosyltransferaseI,β 1,4 GalT I)mRNA在正常和损伤坐骨神经髓鞘上的定位及其表达变化。方法 采用RT PCR方法 ,分析 β 1,4 GalT I在小鼠坐骨神经中的表达水平。将RT PCR扩增的 β 1,4 GalT I片段 ,克隆到pGEM T载体中。采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义 β 1,4 GalT IRNA探针。通过原位杂交及图像分析的方法 ,分析 β 1,4 GalT ImRNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的定位及其表达变化。结果 检测到 β 1,4 GalT I在大鼠坐骨神经的髓鞘中有表达 ,并在坐骨神经损伤后 1～ 2d内表达最高 ,随后表达下降。结论 提示 β 1,4 GalT I可能在周围神经最主要的胶质细胞—施万细胞中表达 ,并在周围神经损伤后发生表达变化 ,这样为进一步分析 β 1,4 GalT I在周围神经再生中的调控机制奠定基础。

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C>T和539G>C变异导致A_2亚型

为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景,发现并鉴定新的ABO等位基因,采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本,PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序,并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型;进一步研究发现,1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因,另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比,差异在外显子7的467C>T和539G>C变异,导致多肽链P156L和R180P的替换。结论首次发现467C>T和539G>C组合的A2等位基因,中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。

肿瘤坏死因子-α和β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在膝关节滑膜炎中的表达及临床意义

目的分析肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β1,4-Galactosyltransferase-Ⅰ,β1,4-GalT-Ⅰ)在膝关节滑膜炎中的表达及临床意义。方法将2016年11月—2019年11月收治的109例膝关节滑膜炎作为研究组,选取同期进行膝关节探查结果正常者57例作为对照组。观察2组滑膜组织中β1,4-GalT-Ⅰ及TNF-α的表达情况,分析不同剂量、不同时长TNF-α刺激对滑膜组织成纤维样滑膜细胞中β1,4-GalT-Ⅰ表达的影响。结果研究组TNF-α、β1,4-GalT-Ⅰ表达水平高于对照组(P<0.05)。研究组β1,4-GalT-Ⅰ的表达水平随TNF-α剂量、刺激时长的增加不断上升,在5 ng/ml TNF-α时达到顶峰,TNF-α刺激4 h时达到高峰,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论膝关节滑膜炎患者滑膜组织中β1,4-GalT-Ⅰ及TNF-α的表达显著增高。不同剂量及不同时长的TNF-α刺激成纤维样滑膜细胞β1,4-GalT-Ⅰ的表达存在差异。

ERK在TNF-α诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I表达中的作用

目的研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-GalT-I)表达的调节作用。方法用不同浓度的TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并作用不同的时间,检测β-1,4-GalT-I表达变化;应用ERK通路抑制剂U0126预处理HUVECs,再用TNF-α刺激HUVECs,检测β-1,4-GalT-I的表达变化,并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HU-VECs黏附能力的改变。结果 TNF-α诱导HUVECsβ-1,4-GalT-I表达增加,且具有剂量和时间依赖关系;U0126显著抑制TNF-α引起的HUVECsβ-1,4-GalT-I表达的上调及其黏附能力的上调。结论 ERK信号转导通路可能参与调节TNF-α诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-I的表达,并影响内皮细胞的黏附能力。

N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶在大鼠坐骨神经损伤后的表达变化

为了分析与 N-糖链合成相关β-1,4-半乳糖基转移酶 - 、 、 (β-1,4-galactosyltransferase , , ,β-1,4-Gal T- , , ) m RNA在正常和损伤坐骨神经组织的表达变化。本研究采用 RT-PCR方法 ,分析 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在。以扩增的 c DNA片断标记探针 ,Northern blot分析β-1,4-Gal T- 、 、 m RNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的表达变化。结果表明 :通过 RT-PCR方法 ,检测到 β-1,4-Gal T- 、 、 在小鼠坐骨神经中的表达存在 ;采用 Northern blot方法 ,发现β-1,4-Gal T- 、 、 在正常大鼠坐骨神经中有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化 ,但三种同功酶的表达变化各不相同。结论 :本实验发现 β-1,4-Gal T- 、 、 在坐骨神经有表达 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。提示与

miR-27a-3p抑制β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ表达对胃癌SGC-7901细胞的影响

目的目前关于胃癌中miRNAs靶向调控β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)表达的具体机制尚不明确。文中旨在分析miR-27a-3p对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移及侵袭的影响,探讨其分子机制。方法生物信息学预测B4GALT3基因的靶miRNAs,针对B4GALT3′UTR与靶miRNA结合位点构建荧光素酶报告基因载体,检测其相对荧光素酶的活性;将miR-27a-3p mimic、mimic NC、control(空白对照)、miR-27a-3p inhibitor、inhibitor NC分别瞬转入SGC-7901细胞后,Western blot检测各转染细胞B4GALT3的表达情况;采用MTT、迁移、侵袭实验检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结果与正常胃黏膜GES-1细胞比较,B4GALT3在胃癌各个细胞系中表达显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-27b-3p能使野生型B4GALT3的荧光素酶的活性显著性降低(P<0.001),说明miR-27a-3p与B4GALT3存在靶向关系。Western blot检测结果显示,瞬转miR-27a-3p mimic后,B4GALT3蛋白水平下降(P<0.05);瞬转miR-27a-3p inhibitor后,B4GALT3表达升高(P<0.01),说明miR-27a-3p对B4GALT3有负性调控作用。24、48、72、96、120 h,与mimic NC、空白对照比较,miR-27a-3p mimic的细胞增殖显著升高(P<0.05);与inhibitor NC、空白对照比较,miR-27a-3p inhibitor的细胞增殖显著降低(P<0.05)。miR-27a-3p mimic的迁移细胞数量[(319.3±13.9)个]较mimic NC[(218.0±10.7)个]明显增加(P<0.000);侵袭细胞数量[(402.0±15.0)个]较mimic NC[(241.0±17.3)个]明显增加(P<0.000)。miR-27a-3p inhibitor迁移细胞数量[(115.6±13.8)个]较inhibitor NC[(214.6±6.8)个]明显减少,迁移能力明显降低(P<0.000)。结论miR-27a-3p通过抑制B4GALT3表达,促进胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭能力,为寻找胃癌治疗靶点提供了实验依据。

奶牛β-1,4-半乳糖基转移酶基因在毕赤酵母GS115中的转化表达及发酵优化

采用电转化法将已构建好的表达载体pPIC9K-GT转化到毕赤酵母(Pichina pastoris)GS115中。通过对电转化条件进行优化,达到了理想的转化效率,得到了大量转化子,并通过表型筛选及PCR鉴定,筛选到阳性转化子。对重组的P.pastoris GS115-GT进行了诱导表达,用SDS-PAGE法检测到目的蛋白质条带,证明β-1,4-半乳糖基转移酶基因(GT)在P.pastoris GS115中能够表达;用苯酚红法测定了粗酶液的活性,其比酶活为16.40 U/ml。对工程菌的发酵条件进行了初步优化,在最佳工艺下的比酶活达到30.909 U/ml,比优化前提高了88.47%。