广西香蕉枯萎病病原菌4号生理小种的分子检测与鉴定

【目的】明确在广西个别香蕉产区发现的香蕉枯萎病病原种类,为防控该病害提供科学依据。【方法】从广西不同香蕉产区采集香蕉枯萎病病株样本,分离纯化获得6株菌株,以香蕉枯萎病1号和4号生理小种为阳性对照,采用特异PCR的方法,对分离到的6株菌株进行分子检测,并用盆栽香蕉和西贡蕉小苗接种进行菌株致病性鉴定。【结果】经ST1/ST2特异引物扩增,1号菌株与香蕉枯萎病菌1号生理小种扩增到约200bp片段;2～6号菌株和香蕉枯萎病菌4号生理小种扩增到约250bp片段。与标样对比结果表明,1号菌株为香蕉枯萎病1号生理小种,2～6号菌株为香蕉枯萎病4号生理小种;盆栽接种致病性鉴定结果与分子检测结果相同。【结论】广西个别蕉区已遭受香蕉枯萎病菌4号小种侵染,各级部门应高度重视。

广西香蕉枯萎病4号生理小种发生情况及香蕉品种抗性鉴定

【目的】明确香蕉枯萎病4号生理小种在广西的发生实况和广西现有香蕉品种对香蕉枯萎病4号生理小种的抗性水平,为制定相应的防控措施提供参考。【方法】在广西香蕉产区随机选择23个村,每村抽取2～3个点,调查香蕉枯萎病4号生理小种的发生情况。用伤根接种法测定11个香蕉品种对香蕉枯萎病4号生理小种的抗性水平。【结果】南宁市西乡塘区、隆安县、钦州市、武鸣县和龙州县均发现香蕉枯萎病4号生理小种发生为害,大多数发病地块的病株率在1.00%～14.00%,病情指数在0.50～10.00,田东县调查点没有发现香蕉枯萎病4号生理小种为害。11个香蕉品种除金粉1号病情指数为50.00,为感病品种(S)外,其他品种病情指数在70.00～100.00,为高感品种(HS)。【结论】香蕉枯萎病4号生理小种已在广西部分产蕉区零星发生,正处于病原菌菌量累积阶段;目前广西栽种的香蕉品种均为感病或高感品种,抵御能力差,需加强对香蕉枯萎病的防控力度。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。

农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种转化体系的优化

香蕉枯萎病是世界范围内香蕉种植区最为严重的病害之一,严重威胁和影响着香蕉产业的发展。本文针对香蕉枯萎病病原菌的4号生理小种,建立了农杆菌介导的转化体系,确定了影响转化效率主要因子的优化体系是:农杆菌在IM培养基诱导前农杆菌OD600为0.15、农杆菌经IM液体培养基诱导的时间为7h、乙酰丁香酮(AS)浓度为150μmol/L、Focr4孢子浓度为1×106个/mL、共培养时间为48h、培养温度为25℃、诱导培养基pH值为5.5。在此条件下,转化效率能达到700～800个转化子/106个香蕉枯萎病菌孢子。PCR验证表明外源的T-DNA已经成功随机地整合到该病原菌基因组中。目前,应用该转化体系已获得2300多个转化子,为后续克隆相关致病基因打下了良好基础。

利用大豆分子连锁图定位大豆孢囊线虫4号生理小种抗性QTL

大豆孢囊线虫 (SCN ,HeteroderaglycinesIchinohe)是一种土传的定居性内寄生线虫 ,是引起大豆黄萎病的病原 ,是大豆生产上危害最大的病害之一。SCN的生理小种多达十几种 ,在我国大豆孢囊线虫病原主要为 4号生理小种 ,它是现有生理小种中致病力最强的小种。经典遗传学研究已经确定大豆孢囊线虫抗性基因由 1- 4对核基因控制 ,估计有 10个以上的抗性座位。近年来分子标记技术及QTL定位方法的发展为深入研究该病害的抗性遗传规律提供了有效的手段 ,这对加速我国抗大豆抗孢囊线虫新品种培育具有重要意义。本研究以晋豆 2 3×ZDD2 315组合F2 群体 (2 5 3个单株 )为试验材料 ,其中灰布支黑豆 (ZDD2 315 )是我国山西省农家品种 ,对大豆孢囊线虫 4号生理小种表现为高抗。利用塑料钵柱法进行SCN抗性鉴定 ,构建大豆孢囊线虫抗性主座位所在区域的分子图谱 ,并进行SCN的QTL定位及遗传效应分析。根据已发表的大豆A和G连锁群的分子遗传图谱 ,应用BSA法 ,获得了 8个与SCN4号生理小种抗性基因相关的SSR标记 ,它们是Satt0 38(176bp/ 182bp) ,Satt30 9(130bp/ 135bp) ,Satt6 10 (2 4 0bp/ 2 2 2bp) ,Sat_14 1(189bp/ 184bp) ,Satt187(30 0bp/ 2 5 0bp) ,Satt315 (2 5 3bp/ 2 4 8bp) ,Satt6 32 (2 86bp/ 2 90bp)和Sat_16

抗大豆孢囊线虫4号生理小种育种骨干亲本抗性差异分析

研究对抗大豆孢囊线虫病育种中常用的 4 0份骨干亲本进行 4号生理小种抗性鉴定 ,其中感病品种 30份 ,黄粒抗病品系 2份 ,黑粒抗病品系 2份 ,黑粒抗源 6份。结果表明 :品种间的抗性有极显著差异 ;抗性的主要差异首先出现在抗性和非抗性品种之间 ,其次出现在非抗性品种内 ;抗源材料的抗性非常稳定 ;亲本对大豆孢囊线虫 4号生理小种的抗性呈连续性变化 ,符合正态分布规律。抗性愈强的品种抗性愈稳定 ,抗性愈弱的品种抗性愈易受环境的影响。大豆抗大豆孢囊线虫的广义遗传力约为 5 3.9%。

香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T-DNA插入突变体的筛选

【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法，建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系，构建病原菌的突变体库并进行筛选，为已突变基因提供分子标记，在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验，研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素，并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8，病原菌孢子浓度106 CFU/mL，转化受体材料为分生孢子，共培养培养基pH 5.4，共培养温度25 ℃，共培养培养基中AS浓度200 μmol/L，共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化，转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达，构建了病原菌的T-DNA插入突变体库，并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体，为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。

中国大豆抗孢囊线虫4号生理小种育种鉴定标准商榷

选择一组抗孢囊线虫4号生理小种育种亲本材料进行抗性鉴定,结果表明:品种间抗性存在极显著差异,且呈现连续性变化,根部孢囊附着量平均表现为0～145个。按照传统孢囊线虫鉴定分类标准,黑种皮的高抗抗源对SCN4号生理小种抗性十分稳定,灰布支黑豆和PI437654的孢囊附着量分别为2.67和0个;绝大部分黄种皮亲本材料抗性均表现为高度感病,只有1267和1259表现为中感。对于4号强毒生理小种的特殊性,实际中将无法选育到抗性品种以解决生产需要问题。利用品种间抗性存在的差异和连续性变化,并比较其它方法,建议抗孢囊线虫4号生理小种育种鉴定标准划分为5级,分别为免疫、高抗、抗、感和高感,其IP指数(%)以Lee为对照时分别为0、0.1～15、15.1～50、50.1～100和>100。黄种皮大豆品种晋豆19号对4号生理小种反应稳定,可作育种参考对照。

应县小黑豆对大豆孢囊线虫4号生理小种抗性的遗传分析

大豆孢囊线虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｉｃｈｉｎｏｈｅ）是大豆生长过程中最具破坏力的病害之一，我国大豆孢囊线虫以４号生理小种危害最为严重。研究其抗性的遗传机理，对我国大豆抗病育种具有重要意义。应县小黑豆是我国山西省农家品种，对大豆孢囊线虫４号生理小种表现为良好的抗性，本研究以应县小黑豆 ｘ晋豆２３组合的后代群体为试验材料，利用塑料钵柱法对Ｆ２和 Ｆ３群体进行抗性鉴定，采用两种抗病性评价标准，对大豆孢囊线虫４号生理小种杭性进行遗传分析。结果表明：采用标准品种法评价应县小黑豆对大豆孢囊线虫４号生理小种的抗性时，由１对隐性基因控制，而采用绝对孢囊数评价应县小黑豆对大豆孢囊线虫４号生理小种的抗性时，由２对隐性基因控制。显然，在晋豆２３与应县小黑豆的杂交组合中，大豆孢囊线虫４号生理小种的抗性表现为隐性遗传，由１～２对隐性基因控制。研究结果还表明，利用Ｆ３代株系进行大豆孢囊线虫杭性鉴定比对马代单株直接进行大豆孢囊线虫抗性鉴定具有更好的稳定性和可靠性。

大豆胞囊线虫4号生理小种不同抗性材料根系分泌物对其抗病性的影响

为研究大豆根系分泌物与大豆对胞囊线虫4号生理小种抗性的关系,以CBL黑豆(抗)和品75-14(感)为试材,收集其不同处理的根系分泌物,测定根系分泌物对胞囊线虫4号生理小种卵孵化的影响和对二龄幼虫的趋化性,并测定了根系分泌物中氨基酸成分及含量,分析了其与大豆对胞囊线虫4号生理小种抗性之间的相关性。结果表明:CBL黑豆根系分泌物能抑制线虫卵的孵化,而品75-14根系分泌物能刺激卵的孵化。品75-14根系分泌物对二龄幼虫趋化性影响显著大于CBL黑豆。在供试材料大豆根系分泌物中共检测出17种氨基酸。无论接种与否,品75-14根系分泌物中氨基酸总量高于CBL黑豆,是CBL黑豆根系分泌物中氨基酸总量的2倍多。与不接种对照相比,接种后CBL黑豆和品75-14根系分泌物氨基酸总量都表现为增加,且品75-14增幅大于CBL黑豆,品75-14根系分泌物中氨基酸总量增加了297.29μg·g-1FW,而CBL黑豆增加了191.15μg·g-1FW。根据氨基酸增幅及变化规律,将氨基酸分为3类:第一类为苯丙氨酸,与大豆对胞囊线虫4号小种的抗性呈正相关;第二类包含3种氨基酸,分别为苏氨酸、丝氨酸和蛋氨酸,与抗性不相关;第三类包含其余13种氨基酸,与抗性呈负相关。

大豆孢囊线虫4号生理小种侵染大豆根系诱导表达的cDNA分析

大豆孢囊线虫 (HeteroderaglycinesIchinohe ;SoybeanCystNematode ,SCN)是一种土传的专性内寄生线虫。SCN的二龄幼虫侵入到大豆幼嫩的根组织中 ,导致大豆根内的细胞变形并与之形成“合胞体”。合胞体在形态上和生理上的变化是SCN直接诱导大豆基因表达的结果。本研究以高抗SCN的灰布支黑豆为材料 ,用大豆孢囊线虫二龄幼虫直接接种大豆的根系 ,应用DDRT -PCR技术及RDB (Reversedot-blotting)杂交鉴定 ,获得 6个阳性cDNA克隆 ,分别是SCN侵染后 5天的A32克隆 (GenBank登录号为BI173978) ;侵染后 10天的B12克隆 (GenBank登录号为BI173979)、B71克隆 (GenBank登录号为BI173980 ) ;侵染后 15天的C11克隆 (GenBank登录号为BI173981)、CP12 (GenBank登录号为BI173982 )克隆和CP32克隆 (GenBank登录号为BI173983)。序列的同源比较表明 ,6个cDNA均与Shoemaker构建的大豆基因表达库中的cDNA序列有非常高的同源性 ,证明这些cDNA是大豆基因表达的产物。其中A32克隆的序列与控制拟南芥下胚轴生长的MYB转录因子、营养元素缺失诱导的番茄根的表达文库中的一个cDNA及番茄抗假单胞杆菌表达文库中的一个cDNA有较高的同源性。

香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4号生理小种micro-like RNA及其靶标基因的鉴定

香蕉枯萎病已严重威胁香蕉产业的发展,为了分析香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum F. sp. cubense race 4,Foc4)中mi RNA-like(mil RNA)及其调控功能,本研究构建了3个Foc4菌丝小RNA测序文库,测序得到原始数据11783990条,其中可用于后续mil RNA鉴定的有效数据3351578条,通过与mi Rbase中植物mi RNA和已报道的真菌mil RNA进行比对,共预测出7个保守的和3个新型的mil RNA。进而利用降解组测序预测mil RNA靶基因,共预测出53对mil RNA-m RNA。通过对靶基因进行GO和KEGG富集分析,发现mil RNA与多个代谢通路有关,包括嘌呤代谢,甘油磷脂代谢,硫胺素代谢和三羧酸循环通路等,对真菌生长发育有重要影响;同时发现mil RNA靶向ABC转运器CDR4和孢子壁成熟蛋白DIT1,可能对Foc4致病过程具有重要影响。本研究在高通量测序获得mil RNA的基础上,首次在香蕉枯萎病致病菌Foc4中利用降解组测序分析了mil RNA靶基因,对研究真菌mil RNA调控提供了重要参考,也为香蕉枯萎病的防治提供了新的思路。

广西香蕉枯萎病菌4号生理小种对桂蕉6号的致病力分化研究

桂蕉6号是广西的主栽香蕉品种,占全区香蕉种植面积的90%以上。为了明确广西香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种对桂蕉6号的致病力,通过采集分离,获得41个香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株,用伤根淋灌法接种香蕉组培苗。根据病菌对桂蕉6号的致病力强弱,上述菌株可以分为3类,其中强致病力菌株22个,中致病力菌株7个,弱致病力菌株12个,分别占供试菌株的53.66%、17.07%、29.27%。由此可见,广西香蕉枯萎病菌4号生理小种存在明显的致病力分化现象,强致病力菌株为优势种群。

抗大豆胞囊线虫病4号生理小种大豆新品种晋豆31号选育

晋豆31号是通过杂交育种,利用抗大豆胞囊线虫病分子标记辅助育种程序,系统选育而成。2003年经中国农业科学院植保所进行抗大豆胞囊线虫病4号生理小种鉴定,其抗性为抗病,2003—2004年参加山西省大豆中晚熟区域试验和生产试验,产量为200 kg/667m2左右。该品种为我国抗胞囊线虫4号生理小种育种的新突破,适应山西中部、黄土高原和黄淮海同类地区,特别是胞囊线虫重病区春播及南部地区夏播。

大豆抗胞囊线虫4号生理小种SSR标记筛选及优异种质鉴定

大豆抗胞囊线虫的表型鉴定工作量较大,鉴定结果易受环境影响,是抗源筛选和抗病品种选育的限制因素之一。不受时间、环境限制的分子标记鉴定为抗病鉴定提供了一种高效快捷准确简单的鉴定方法。为筛选可用于抗大豆胞囊线虫4号生理小种分子标记引物,本研究采用基因型鉴定和人工接种鉴定相结合的方法鉴定193份大豆资源的大豆胞囊线豆抗性。以部分高抗大豆资源和高感资源为材料,对1000对SSR引物进行初筛,用初筛获得的引物扩增193份抗、感大豆资源,筛选抗胞囊线虫4号生理小种(SCN 4)SSR标记引物,用于大豆抗胞囊线虫4号生理小种分子标记辅助鉴定。结果表明:筛选出4个与大豆胞囊线虫4号生理小种相关的SSR标记,分别为Satt400、Satt680、Satt533和Satt504。Satt400、Satt680、Satt533和Satt504对感病资源的检出率均为100%,对抗病资源的检出率分别为70.58%、63.15%、92.3%和57.14%。结合人工接种鉴定结果显示,4个标记组合鉴定可提高对胞囊线虫4号生理小种抗性的选择效率,达100%。经人工接种鉴定,从193份资源中筛选出12份抗病资源,其中10份资源为高抗,2份资源为中抗。这12份抗源的4个SSR标记带型均为抗病带型,其余感病和高感资源的4个SSR标记带型则至少有一个为感病带型。因此,利用分子标记评价抗感特性的标准为被1个或1个以上的感病带型检出的资源为感病资源,当4个标记均为抗病带型,该资源为抗病资源。利用该引物组合对山西省种质库提供的100份资源进行鉴定。筛选出4份抗源,人工接种鉴定结果表明,黑豆、小颗黑和晋1265(茶)3份资源抗性级别为高抗,大黑豆抗性级别为中抗。因此,该引物组合可有效辅助鉴定大豆对胞囊线虫4号生理小种的抗性。

大豆种质资源抗SCN4号生理小种的鉴定研究

采用病圃自然感病鉴定法 ,对我国 7省 5 18份大豆新种质资源进行了抗大豆胞囊线虫SCN4号生理小种的鉴定研究 ,筛选出 3个新的抗病品种。这些抗病品种均来自山西 ,种皮为黑色 ,每株平均胞囊数在 0 .2～ 0 .6之间 ,抗性强而稳定 ,可供抗病育种利用。

不同抗胞囊线虫4号生理小种组合F_2胞囊附着量差异分析

选择4对均由高抗胞囊线虫4号生理小种抗源和非抗源亲本组成的杂交组合,对其后代胞囊附着量进行差异分析,结果表明,抗源亲本灰布支、应县小黑豆和交城黑豆对胞囊线虫4号生理小种抗性稳定,胞囊附着量在1.08～3.25个之间;非抗源亲本对胞囊线虫的反应有明显差异,这种差异对后代的胞囊附着量和分布有显著影响。4个非抗源亲本中,晋豆19号、晋豆23号、汾豆46号和中作88D09胞囊平均附着量分别为15.36,18.31,17.83,69.50个,F2胞囊平均附着量分别为15.31,35.04,29.93,45.88个,变异系数分别为11.78%,25.23%,22.89%和29.57%,单株胞囊附着量≤5个的比率分别为15.34%,4.62%,7.05%,1.60%。

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的磷酸化应激诱导蛋白1(FoSTIP1)基因的克隆及表达分析

本研究克隆了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4,Foc4)转录因子FoS kn7一个候选的下游基因,结果表明该基因cDNA编码序列全长1737 nt,编码一个含578个氨基酸残基的蛋白质。对其编码的蛋白进行了结构域和进化分析,结果表明该蛋白质含有胁迫诱导蛋白(stress-in-ducible protein-1, STI1)结构域和多个三角形4肽重复序列结构域(tetratricopeptiderepeat,TPR)。该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1(STIP1)亲缘关系最近,因此初步将其确定为Foc4的磷酸化应激诱导蛋白并命名为FoS TIP1。采用相对荧光定量PCR方法分析了该基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下的表达变化,也分析了FoSKN7基因缺失突变体中该基因在外源H_2O_2诱导情况下的表达。结果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下,B2菌株中的FoSTIP1表达均有上调,而FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1即使有H_2O_2诱导,其表达也远低于B2菌株中的FoSTIP1。推测FoSTIP1可能是FoS kn7的靶基因并参与了Foc4抗外源氧化胁迫。

香蕉枯萎病菌4号生理小种密码子使用偏好性分析

为了解香蕉枯萎病4号生理小种基因组的密码子使用特点,掌握其基因编码规律,以香蕉枯萎病4号生理小种基因组的13 303条高置信蛋白的编码信息为数据来源,借助CodonW等软件对蛋白质的每个氨基酸编码数据进行统计分析,研究获得了UCC和CCC等8个密码子为最优密码子,第三个碱基为C的密码子具有更高的选择性。进一步统计分析了mRNA的编码区长度,发现密码子使用偏好性随着编码区的延长而降低,较长编码区的基因对密码子的使用无显著偏好性,为建立和优化香蕉枯萎病菌的遗传转化系统具有直接的指导作用。