Ⅳ型胶原蛋白A4在肾透明细胞癌中的表达及其与预后和免疫浸润的相关性分析

目的探究Ⅳ型胶原蛋白A4(collagen typeⅣalpha 4 chain,COL4A4)在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中的表达及其与临床预后和免疫浸润的关系。方法利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库分析COL4A4在ccRCC组织和癌旁正常组织中的表达差异。Western blot实验探究COL4A4在人ccRCC细胞株(786-O、OS-RC-2、Caki-1、SW839和RCC4)和人正常肾小管上皮细胞株HK-2中的表达差异。Kaplan-Meier曲线用于分析COL4A4表达与ccRCC患者的临床总生存期、无进展生存期和疾病特异性生存期的关系,并用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价COL4A4对预测ccRCC发生的诊断价值。利用cBioPortal和COSMIC数据库分析COL4A4在ccRCC中的突变情况。采用STRING数据库构建COL4A4的蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络。采用LinkedOmics数据库构建COL4A4的共表达基因网络。采用R软件进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析。基于TCGA数据的单样本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)分析ccRCC中COL4A4表达与免疫浸润的相关性。结果TCGA和GEO数据库均显示,COL4A4在ccRCC组织中低表达(均P<0.05)。Western blot实验证实,COL4A4在ccRCC细胞株(786-O、OS-RC-2、Caki-1、SW839和RCC4)中均低表达(均P<0.05)。高表达COL4A4的患者具有更好的总生存期、无进展生存期和疾病特异性生存期(均P<0.01)。COL4A4是ccRCC患者的独立危险因素(HR=0.562,95%CI:0.352~0.898,P<0.05)。COSMIC数据库发现,COL4A4突变频率较低,在ccRCC中稳定表达。PPI网络显示,COL4A4与整合素家族密切相关。功能富集分析发现,COL4A4参与GTP酶活性调节、细胞核分裂、细胞周期转换、自噬和T细胞激活等生物学过程。信号通路富集分析提示,COL4A4主要参与沙门氏菌感染和细胞间的紧密连接。免疫浸润分析发现,COL4A4表达与调节性T细胞浸润呈负相关(r=-0.428,P<0.05)。结论COL4A4是ccRCC的潜在生物预后标志物和治疗靶点。

1,25-(OH)_2-VD_3下调糖尿病肾病肾脏组织p38MAPK和胶原蛋白的表达

目的研究2型糖尿病肾间质纤维化中p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）、Ⅲ型胶原蛋白（Col3）和Ⅳ型胶原蛋白（Col4）表达，及1，25-（OH）2-VD3对其表达的影响；探讨p38MAPK与Col3和Col4表达的相关性。方法以高糖高脂饮食联合30mg／kg链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠2型糖尿病模型。将60只大鼠随机平均分为对照组、模型组、1，25-（OH）2-VD3治疗组[建模后给予6ng／（100g·d）1，25-（OH）2-VD3治疗]、胰岛素组（建模后给予2～3U胰岛素治疗）。干预8周后检测4组血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、24h蛋白尿水平；过碘酸希夫反应（PAS）染色观察肾脏病变情况；采用Western blot及免疫组织化学染色检测大鼠肾间质p38MAPK、CoD和Col4的表达；采用Spearman法进行相关性分析。结果与模型组相比，1，25-（OH）2-VD3治疗组和胰岛素治疗组血清肌酐、尿素氮、24h蛋白尿和肾间质受损面积均降低；与对照相比，模型组p38MAPK、Col3和Col4水平增加，1，25-（OH）2-VD3治疗组和胰岛素治疗组明显降低；相关性分析发现24h蛋白尿与p38MAPK、CoB和Col4免疫组织化学的结果呈正相关，p38MAPK的表达与Col3和Col4表达呈正相关。结论2型糖尿病大鼠肾间质组织p38MAPK、Col3和Col4表达上调，1，25-（OH）2-VD3可能通过p38MAPK下调Col3、Col4的表达改善糖尿病肾病肾组织纤维化。

转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)促进缺氧诱导的肾小管间皮细胞转分化

目的研究长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)参与缺氧诱导的肾小管上皮细胞上皮间质转分化(EMT)调控的机制。方法 HK-2肾小管上皮细胞缺氧处理0、12、24、48、72 h,实时定量PCR检测MALAT1 mRNA和miR-100-3p水平。HK-2细胞分别感染特异性lncRNA慢病毒和miRNA慢病毒下调MALAT1和miR-100-3p,采用实时定量PCR检测MALAT1 mRNA和miR-100-3p水平,免疫荧光细胞化学染色检测上皮钙黏素(ECD)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅳ型胶原蛋白α1链(COL4A1)的表达。构建单侧输尿管梗阻(UUO)动物模型,设置单侧输尿管未结扎组(对照组)、结扎7 d组(UUO7 d组)、结扎3周组(UUO 3周组)、腺相关病毒(AAV)组。在UUO动物模型中,采用AAV感染下调MALAT1水平后,采用HE和Masson染色检测各组肾组织病变情况,采用免疫组织化学染色检测肾组织ECD和α-SMA的表达。结果在缺氧诱导的HK-2细胞中,随缺氧刺激时间延长,MALAT1表达逐渐升高,而miR-100-3p表达逐渐减低;缺氧诱导HK-2细胞72 h后,慢病毒感染下调MALAT1水平,miR-100-3p水平升高,同时ECD表达增加、COL4A1和α-SMA表达降低;缺氧诱导HK-2细胞72 h后,转染下调miR-100-3p水平,MALAT1水平无显著变化,miR-100-3p水平降低,ECD表达降低,COL4A1和α-SMA表达增加;体内实验:与对照组相比,UUO动物模型组MALAT1表达显著升高,而miR-100-3p表达明显降低; AAV组与3周组比较,ECD表达显著升高,而α-SMA表达显著降低。结论 MALAT1可通过负向调控miR-100-3p,进而促进COL4A1表达,促进缺氧诱导的HK-2细胞EMT,并且可以促进UUO肾病小鼠肾脏纤维化。