CYP2D6基因多态性与他莫昔芬及4-羟基他莫昔芬血清浓度的相关性研究

目的 探讨CYP2D6基因多态性与乳腺癌患者他莫昔芬（TAM）及其活性代谢产物4-羟基他莫昔芬（4-OH-TAM）血清浓度的相关性.方法 收集2008年1月~2010年10月期间200例服用TAM的乳腺癌患者的口腔粘膜及血清,采用Real-time RT-PC法检测CYP2D6＊10基因多态性,采用液相色谱-质谱方法 （LC-MS）测定患者体内TAM及其活性代谢物4-OH-TAM的的血清浓度.结果 200例乳腺癌中检测到CYP2D6＊10/＊10纯合子94例（47%）,CYP2D6 wt/wt野生型48例（24%）,CYP2D6 wt/＊10杂合型58例（29%）.CYP2D6 wt/wt野生型和wt/＊10杂合型两组4-OH-TAM的血清浓度都明显高于＊10/＊10纯合型（P〈0.05）,各基因型之间TAM血清浓度值差异无统计学意义（P〉0.05）.结论 乳腺癌患者CYP2D6＊10/＊10基因型影响他莫昔芬的体内代谢过程,与疗效相关,服用TAM前均应推荐检测CYP2D6＊10/＊10基因型.

4-羟基他莫昔芬对前列腺基质细胞增殖与凋亡的作用

目的：研究4-羟基他莫昔芬（OHT）对原代培养的前列腺基质细胞增殖与凋亡的影响。方法：以10^-8-10^-5mol/L的雌二醇（E2）、己烯雌酚（DES）、OHT以及10^-8-10^-6mol/L的E2与10^-7mol/L的OHT混合物分别作用于原代培养的前列腺基质细胞,采用MTT法和TUNEL法分别检测细胞增殖和凋亡。结果：OHT对前列腺基质细胞增殖和凋亡的作用与E2和DES比较均有显著差异（P均〈0.05）,在10^-7-10^-5mol/L浓度下表现出与浓度相关（r=-0.383,P=0.005）的抑制增殖作用（P〈0.05）,10^-7mol/L的OHT可以抑制相同甚至更高浓度（10^-6mol/L）E2的促增殖作用（P〈0.05）;OHT在10^-8-10^-5mol/L浓度下显示与浓度相关（r=0.349,P=0.012）的促凋亡作用（P〈0.05）,且10^-7mol/L OHT的促凋亡作用不能被相同甚至更高浓度（10^-6mol/L）E2所逆转（P〉0.05）。结论：OHT在一定浓度范围内对原代培养的前列腺基质细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用,该作用可能不完全是通过竞争性抑制雌激素受体而实现的。

雌激素受体拮抗剂他莫昔芬和4-羟基他莫昔芬治疗非小细胞肺癌的实验研究

[目的 ]探讨雌激素受体拮抗剂在非小细胞肺癌治疗中的作用。 [方法 ]用逆转录多聚酶链式反应 (RT-PCR)测定肺腺癌细胞株 SPC- A- 1的雌激素受体 m RNA(ER- m RNA)表达 ,分别在去激素培养条件下观察不同浓度的他莫昔芬 (Tam)、4-羟基他莫昔芬 (OHTam)和雌二醇 (E2 )对其生长速度、细胞周期时相、ER- m RNA水平和细胞形态学的影响。 [结果 ] SPC- A- 1肺腺癌细胞株有 ER- m RNA表达 ,低浓度 E2 (1 0 -8mol/ L)可促进其生长 ,Tam(1 0 -6mol/ L )和 OHTam(1 0 -6mol/ L)可抑制 E2 (1 0 -8mol/ L )的生长刺激作用。去激素环境下细胞生长明显减慢 ,在无激素环境中亦能抑制细胞生长 ,抑制发生在 G0 / G1 期 ,并有细胞内质网扩张等结构改变 ,ER- m RNA表达水平下降。 [结论 ]肺腺癌 SPC- A- 1细胞株的生长具有雌激素依赖性 ,应用 ER拮抗剂 Tam和 OHTam能抑制其生长。肺癌细胞中

4羟基他莫昔芬应激MCF-7乳腺癌细胞上清对巨噬细胞极化的影响

目的探讨4羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,4-OHTAM)刺激MCF-7乳腺癌细胞后上清对巨噬细胞极化的影响。方法实验组分别用不同浓度(2.5、5、10、15、20μmol/L)的4-OHTAM刺激MCF-7乳腺癌细胞2 h和5 h,提取细胞上清液,对照组未经4-OHTAM处理;Western blot检测MCF-7细胞中应激蛋白C/EBP家族同源蛋白(C/EBP-homologous protein,Chop)及葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,Grp78)的表达水平。并将上清与佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导6 h的人白血病单核细胞株THP-1共同培养66 h后,获得贴壁巨噬细胞。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测巨噬细胞上清中白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)及白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin 1 receptor antagonist,IL-1Ra)的水平;Western blot检测巨噬细胞IL-1Ra及CD206的表达水平。结果5μmol/L的4-OHTAM刺激MCF-7细胞5 h后,实验组中应激蛋白Chop和Grp78表达水平明显上调(P<0.05);巨噬细胞上清中细胞因子IL-10和IL-1Ra的水平以及细胞中CD206和IL-1Ra的蛋白表达水平在4-OHTAM浓度为5μmol/L时水平最高(P<0.05)。结论5μmol/L的4-OHTAM刺激MCF-7细胞5 h后,MCF-7细胞发生了细胞应激,并且释放的细胞因子可以诱导巨噬细胞向M2型极化转变,这种极化方向的改变可能对乳腺癌的发生发展及4-OHTAM耐药有一定影响。

4-羟基他莫昔芬对泌乳素腺瘤GH3细胞增殖和分泌的影响

目的探讨雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(OHTam)对泌乳素腺瘤GH3细胞增殖和分泌泌乳素的影响。方法用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)的方法测定泌乳素腺瘤GH3细胞中雌激素受体-mRNA(ER-mRNA)的表达,并观察在去激素培养条件下以及不同浓度的OHTam和雌二醇(E)2对GH3细胞生长速度、生长抑制率、雌激素受体-mRNA(ER-mRNA)及泌乳素分泌水平的影响。结果在E(210-8mol/L)组细胞吸光度为0.561±0.018,抑制率为-0.06,细胞计数、生长抑制率、ER-mRNA及泌乳素分泌水平与去激素培养组差异显著(P<0.05);E(210-8mol/L)﹢OHTam(10-6mol/L)组吸光度为0.504±0.014,抑制率为0.08,细胞计数、ER-mRNA及泌乳素分泌水平与E(210-8mol/L)组差异显著(P<0.05)。结论泌乳素腺瘤GH3细胞有雌激素受体表达,E2可以促进GH3细胞的增殖和泌乳素的分泌,而雌激素受体拮抗剂OHTam能够有效抑制雌激素的作用。

4-羟基他莫昔芬通过抑制DNMT1/DNMT3A表达逆转三阴性乳腺癌细胞间质表型

目的探讨4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)能否通过上调微小RNA-200c(microRNA-200c,miR-200c)表达抑制DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)1和DNMT3A,从而逆转三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞间质表型。方法采用Western Blot检测雌激素受体-α(estrogen receptor-α,ER-α)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2),DNMT1,DNMT3A,Vimentin和Actin蛋白的表达。采用实时荧光定量PCR技术检测miR-200c的相对表达量。应用网络数据库及在线分析软件预测miR-200c启动子的CpG岛。结果不同表型乳腺癌细胞miR-200c表达差异显著;4-OHT上调TNBC细胞miR-200c表达;miR-200c启动子存在CpG岛;4-OHT能够上调miR-200c影响DNMT1/DNMT3A表达。结论TNBC细胞miR-200c表达降低,4-OHT能够上调TNBC细胞中miR-200c表达。4-OHT通过上调间质样TNBC细胞miR-200c表达,抑制DNMT1、DNMT3A表达,从而逆转间质样表达。

HIF-1α调控4-羟基他莫昔芬对乳腺癌MCF-7细胞敏感性的研究

目的该研究通过建立人乳腺癌4-羟基他莫昔芬(4-OHT)耐药细胞系(MCF-7/TR),探究低氧诱导因子1α(HIF-1α)对乳腺癌MCF-7细胞4-OHT耐药的影响。方法采用他莫昔芬的体内活性形式4-OHT建立乳腺癌耐药细胞MCF-7/TR。MTT实验检测4-OHT对乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7/TR细胞活力的影响,并测定耐药指数(RI);Western blot检测MCF-7、MCF-7/TR细胞中HIF-1α蛋白的表达水平;采用MTT法和流式细胞术AV/PI双染法检测,HIF-1α抑制剂(LW6)或siRNA HIF-1α干预作用后4-OHT对MCF-7/TR细胞的影响以及HIF-1α稳定剂(FG-4592)处理后4-OHT对MCF-7细胞的影响。结果结果显示,MCF-7/TR耐药细胞株成功构建,其RI为(5.56±0.80);与MCF-7细胞相比,MCF-7/TR细胞中HIF-1α高表达,且4-OHT作用后MCF-7/TR细胞中HIF-1α的表达水平上调;给予LW6或沉默HIF-1α的表达后,HIF-1α的表达下调增强了4-OHT对MCF-7/TR细胞的抑制作用;给予FG-4592后,HIF-1α的表达上调可降低4-OHT对MCF-7细胞的抑制作用。结论HIF-1α在乳腺癌MCF-7细胞4-OHT耐药中发挥重要作用,靶向HIF-1α可能是增加乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性的有效途径。

4-羟基他莫昔芬通过雌激素受体GPR30激活ezrin蛋白促进人乳腺癌MCF-7细胞迁移

目的:观察4-羟基他莫昔芬(OHT)对人乳腺癌细胞株MCF-7迁移的影响并探讨其机制。方法:贴壁培养雌激素受体阳性人乳腺癌细胞株MCF-7,细胞划痕愈合实验观察OHT对MCF-7细胞迁移的影响,Western blotting检测c-Src/p-Src和ezrin/p-ezrin蛋白的表达。结果:(1)与对照组相比,单独给予MCF-7细胞雌二醇(E2)和OHT都能促进细胞迁移,OHT不能抑制E2对MCF-7细胞的促迁移效应。(2)OHT促进MCF-7细胞迁移最大效应浓度约为5μmol/L,在6 h即能观察到明显促迁移效用。(3)OHT和雌激素受体G蛋白偶联受体30(GPR30)激动剂G1都能明显增加p-Src和p-ezrin蛋白表达。(4)分别用G15和PP2阻断GPR30和Src后,OHT激活ezrin作用都能被阻断。结论:OHT可能通过结合GPR30后激活Src蛋白,进而磷酸化激活ezrin,介导细胞骨架重构并促进MCF-7细胞迁移。

4-羟基他莫昔芬依赖的内含肽调控绿色荧光蛋白功能研究

目的:验证小分子4-羟基他莫昔芬(4-HT)依赖的内含肽调控绿色荧光蛋白(eGFP)功能的可行性。方法:根据eGFP的结构与功能,在蛋白上选取7个氨基酸位点,通过同源重组方式将内含肽序列插入不同位点,转染293T细胞系后通过流式细胞术检测eGFP的表达情况,分析4-HT依赖的内含肽调控剪接效率。结果:在选取的7个氨基酸位点中,有5个具有调控效果,其中S148位点的4-HT调控效果最好,4-HT的最适工作浓度为4μmol/L。结论:在eGFP蛋白上发现一个新的高效的4-HT调控的内含肽剪接位点S148,与已报道位点R109相比,剪接效率提高8倍。

中国人CYP3A5和CYP2D6基因多态性与他莫昔芬及其活性代谢物血药浓度的相关性

目的:研究中国汉族人群CYP3A5和CYP2D6基因多态性与乳腺癌患者体内他莫昔芬及其活性代谢物4-羟基他莫昔芬血药浓度的相关性。方法:30例乳腺癌患者,应用PCR方法检测其CYP3A5和CYP2D6基因型,应用LC-MS/MS方法测定患者体内他莫昔芬及其活性代谢物4-羟基他莫昔芬的含量,对试验数据进行统计分析。结果:CYP3A5基因型与乳腺癌患者体内他莫昔芬的浓度差异有统计学意义,比较发现*1/*1和*1/*3组的他莫昔芬的浓度值明显低于*3/*3组(P<0.01)。CYP2D6基因型与其活性代谢物4-羟基他莫昔芬的浓度差异有统计学意义;*1/*1和*1/*10两组4-羟基他莫昔芬的浓度值都明显高于*10/*10组(P<0.01),但*1/*1组和*1/*10组之间4-羟基他莫昔芬的浓度值差异无统计学意义(P>0.05)。结论:乳腺癌患者的CYP3A5和CYP2D6基因型影响他莫昔芬的体内代谢。

应用他莫昔芬治疗的乳腺癌患者进行CYP2D6联合SULT1A1基因多态性检测2例

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一,在我国每年新发病例约为27万,且发病率逐年递增[1]。我国的女性乳腺癌患者雌激素受体(ER)的阳性率可达70%,这部分患者的辅助内分泌治疗通常首选他莫昔芬(Tamoxifen,TAM),早期乳腺癌临床试验协作组(EBCTCG)的研究显示,初次确诊为乳腺癌的患者采用TAM进行内分泌的辅助治疗能够显著降低15年复发和死亡率[2]。受个体差异因素的影响,约有30~50%的乳腺癌患者采用TAM辅助治疗预后较差或治疗失败[3]。有研究发现,他莫昔芬能够被CYP2D6酶充分代谢,催化产生高活性代谢物4-羟基他莫昔芬和4-羟-N-去甲基他莫昔芬。CYP2D6慢代谢者体内活性代谢物的水平较低。

LC-MS/MS法测定大鼠血浆中他莫昔芬与其活性代谢物4-羟基他莫昔芬的浓度及其药动学研究

目的:建立大鼠血浆中他莫昔芬与其活性代谢物4-羟基他莫昔芬浓度的测定方法,并研究其在大鼠体内的药动学。方法:取大鼠8只灌胃给予他莫昔芬10mg·kg-1,检测给药前和给药后48h内他莫昔芬和4-羟基他莫昔芬的血浆浓度,并计算其药动学参数。采用液相色谱-串联质谱法,以维拉帕米为内标,色谱柱为PhenomenexGeminiC18,流动相为甲醇-0·025%甲酸水溶液(梯度洗脱),流速为0·25mL·min-1,柱温为40℃;电喷雾正离子源,他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬和维拉帕米的选择检测离子质荷比(m/z)分别为372·3→129·1、388·4→128·9、455·3→165·0。结果:他莫昔芬和4-羟基他莫昔芬检测浓度的线性范围分别为1～500(r=0·9998)、0·5～50(r=0·9995)ng·mL-1,最低检测限分别为0·05、0·1ng·mL-1;药动学参数分别为t1/2β:(8·9±0·5)、(8·6±0·7)h,cmax:(112·2±39·2)、(31·1±5·6)ng·mL-1,AUC0～48h:(1501·1±213·8)、(431·2±31·8)ng·h·mL-1。结论:本方法专属性强、灵敏度高、准确性好,可用于他莫昔芬和4-羟基他莫昔芬的血药浓度测定。他莫昔芬和4-羟基他莫昔芬在大鼠体内的药动学符合一室模型特征。

4-羟基他莫昔芬对体外培养前列腺平滑肌细胞的作用

目的研究4-羟基他莫昔芬（OHT）对原代培养的前列腺平滑肌细胞增殖与凋亡以及雌、雄激素受体表达的影响。方法以不同浓度的雌二醇（E2）、乙烯雌酚（DES）和OHT分别作用于原代培养的前列腺平滑肌细胞，采用流式细胞术检测增殖和凋亡，免疫细胞化学检测雌、雄激素受体表达。结果DES和E2在一定浓度范围内起促增殖作用（均P〈0．05），但未发现明显的浓度相关性（DES：r=-0．101，P=0．328；E2：r=-0．115，P=0．188）。OHT浓度在1×10^-8mol／L时，前列腺平滑肌细胞增殖率为5．04％±0．65％，随着浓度由1×10^-6mol／L升高为1×10^-5mol／L，细胞增殖率由2．79％±0．54％下降为0．93％±0．40％。在更高浓度下显示与浓度相关的促凋亡作用（5．83％±0．78％、13．70％±0．71％、19．53％±0．90％），以上作用不能被相同甚至更高浓度的E2所逆转。OHT对雌、雄激素受体表达的影响与雌激素相近。结论OHT在一定浓度范围内对原代培养的前列腺平滑肌细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用，且该作用可能不依赖于雌激素受体途径。口服他莫昔芬后OHT血药浓度较低和OHT上调雄激素受体表达可能是他莫昔芬治疗前列腺增生效果不佳的原因。

4-羟基他莫昔芬对泌乳素腺瘤GH3细胞PTTG表达的影响

目的探讨雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬（OHTam）对泌乳素腺瘤GH3细胞中垂体瘤转化基因ferrc）表达的影响。方法采用逆转录多聚酶链式反应（RT—PCR）和Westem blot法，测定GH3细胞中肿GmRNA和PTTG蛋白表达。在去激素培养条件下观察不同浓度的4-羟基他莫昔芬（OHTam）和雌二醇（E2）对细胞生长速度、PTTG GmRNA和PTTG蛋白表达水平的影响。结果GH3细胞在去激素环境下细胞生长明显减慢，低浓度E2（1×10^-8mol／L）可促进其生长，OHTam（1×10^-6mol／L）可抑制E2（1×10^-8moVE）的生长刺激作用：GH3细胞中存在PTTG mRNA和PTTG蛋白的表达，且OHTam（1×10^-6mol／L）可抑制它们的表达水平。结论泌乳素腺瘤GH3细胞的生长具有雌激素依赖性，应用雌激素受体拮抗剂OHTam能抑制GH3细胞生长和PTTG原癌基因的表达水平。

毛囊真皮鞘细胞中过表达Noggin对皮肤及毛囊生长的作用

背景:Noggin蛋白是一个抑制BMP信号通路的重要分子,可以与BMP2/4结合形成复合物,从而阻断BMP信号,影响生物有机体的正常发育过程。研究认为真皮鞘细胞是一类能够长期自我更新的真皮干细胞,参与毛囊再生过程中真皮毛乳头和真皮鞘的形成。在毛囊发育过程中,真皮毛乳头中Noggin参与毛囊的起始,Noggin的缺失会导致毛囊数量的减少和毛囊生长缓慢,但人们对于Noggin蛋白在毛囊真皮鞘中的作用所知甚少。目的:研究Noggin蛋白在毛囊真皮鞘中的生物学功能。方法:利用真皮鞘特异的αSMA-Cre ERT2工具鼠在真皮鞘中特异过表达Noggin蛋白,分别在出生后8,9 d对实验组αSMA-CreER;pMES-Noggin小鼠和对照组αSMA-CreER小鼠注射4-羟基他莫昔芬,在出生后21,23,28 d获取皮肤组织,苏木精-伊红染色观察毛囊生长情况和皮下脂肪层厚度,免疫组化染色分析表型。结果与结论:通过苏木精-伊红染色结果发现毛囊生长并没有受到影响,但毛囊皮下脂肪组织生长发育受到严重影响,小鼠皮下脂肪层变薄。免疫组化结果说明BMP信号降低可能是导致毛囊脂肪层变薄的原因。这一发现拓展了人们对于真皮鞘细胞和Noggin蛋白的认识,也为人们更加准确理解毛囊再生和组织生长机制提供了重要依据。

他莫昔芬药物基因组学研究进展

他莫昔芬(tamoxifen,TAM)作为最常用的非甾体类抗雌激素药物,广泛用于雌激素受体/孕激素受体阳性的乳腺癌患者的辅助治疗。TAM主要通过肝脏的细胞色素P450酶代谢为活性产物4-羟基他莫昔芬(4-OHTAM)和N-去甲基-4-羟基-他莫昔芬(EDF),从而发挥药理作用。4-OH-TAM和EDF与受体结合的能力比TAM高30至100倍,从而能够有效的抑制雌激素受体依赖的乳腺癌细胞的细胞周期。CYP3A4和CYP2D6作为TAM主要代谢酶参与其代谢形成活性代谢物,这两种细胞色素酶都具有等位基因多的特点。CYP3A4和CYP2D6的基因多态性会影响TAM在患者体内的活性代谢物的血药浓度,从而可能会影响其治疗效果。参与TAM体内过程的主要转运体的基因多态性也会影响TAM在患者体内的血药浓度,进而影响接受TAM治疗的乳腺癌患者的临床预后效果。本文总结了TAM体内过程相关的代谢酶及转运体等的基因多态性与TAM活性代谢物浓度/疗效/不良反应的相关性,为进一步的药物基因组学研究以及临床合理用药提供参考。

离线紫外照射和高效液相荧光法测定他莫昔芬及代谢物在人血浆中的浓度

目的建立高效液相荧光法测定人血浆中他莫昔芬及主要代谢物浓度。方法血浆样品经正己烷-正丁醇（98∶2）提取后,以甲醇-1%三乙胺水溶液（82∶18）为流动相,流速为1mL·min-1,色谱柱为Agilent Extend C18（4.6mm×150mm,5μm）,柱温为50℃,离线紫外照射（254nm）10.5min,使目标化合物转变成强荧光性的菲衍生物,荧光检测波长：激发波长（λex）260nm,发射波长（λem）375nm。结果血浆内源性杂质不干扰待测物测定,线性范围分别为：他莫昔芬为0.5~200μg·L-1;N-去甲他莫昔芬为0.5~300μg·L-1;4-羟基他莫昔芬为0.1~10μg·L-1。日内、日间精密度（RSD）均小于10%。样品4次冻融,以及在提取后,4℃下12h内稳定性良好。结论该法灵敏、快速、准确,操作简便、线性范围宽,可用于他莫昔芬的药动学研究及常规治疗药物监测。

三七提取物对大鼠体内他莫昔芬及其代谢物的药动学的影响

目的:研究三七提取物对大鼠体内他莫昔芬及其代谢物的药动学的影响。方法:口服给予大鼠三七提取物10 d后再分别予口服、静注他莫昔芬,采用LC-MS/MS方法,测定他莫昔芬和4-羟基他莫昔芬在血浆和胆汁中的浓度,比较药动学行为的改变情况。结果:三七提取物未改变他莫昔芬及其代谢物的血浆药动学参数,但能明显影响他莫昔芬及其代谢物的口服吸收和胆汁排泄。结论:三七提取物对大鼠体内他莫昔芬及其代谢物的口服吸收和胆汁排泄存在影响,临床上二者合用时应注意潜在的药物相互作用。