婴儿型糖原累积病Ⅳ型1例临床、肝脏病理特征及1，4-α-葡聚糖分支酶基因分析

目的探讨糖原累积病Ⅳ型（GSDIV）患儿的临床特点、实验室检查及其家系的基因突变情况。方法患儿，男，1岁7个月，因“腹胀1年余，肝脾大5d”就诊，进行详细的病史询问、体格检查、实验室检查，并行肝组织电镜检查，对患儿及其父母的外周血基因测序，查找致病基因及突变位点。结果患儿婴儿期起病，主要表现为肝脾大、食欲欠佳，血清转氨酶升高，空腹血糖正常，串联质谱无异常，骨髓细胞学检查见体积大、胞质蓝染、染色质细和少量核仁的不明细胞。肝脏电镜检查示糖原水平不同程度增多，胞质内充满低电子密度物质。基因测序分析提示患儿1，4-α-葡聚糖分支酶基因（GBE1）存在2个新的杂合错义突变，分别为c．1229T〉G、c．785G〉A，2个突变分别来自患儿父母，均不属于多态性位点，在人群中发生率极低，在人类基因突变数据库中未见报道。结论GSDIV是由GBE1基因突变所致，临床罕见，可累及多个脏器，需与多种疾病鉴别，诊断可依赖基因分析，而新的GBE1基因突变类型仍在更新。

发菜1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)的基因克隆及其对干旱胁迫的响应

由glgB基因编码的1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)是催化调控α(1-6)糖苷键分支合成的关键酶。本研究从发菜中克隆获得1,4-α-葡聚糖分支酶glgB基因全长2 292 bp(GeenBank登录号:KX679395),编码763个氨基酸。原核表达得到88.6 kD的glgB基因外源蛋白,MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析表明外源蛋白为GBE。发菜glgB与点形念珠藻的glgB序列相似性为94%,氨基酸序列相似性为97%;GBE在第747位的甘氨酸疏水性最强,第168位的组氨酸亲水性最强;Thr有15个磷酸化位点,Tyr有12个磷酸化位点、Ser有27个磷酸化位点;GBE二级结构及三级结构由α螺旋、β折叠、随机卷曲和β转角构成。发菜glgB在干旱胁迫下转录水平的表达量逐渐增加,GBE含量增加,糖原合成酶活性和糖原含量均先增加后降低。研究结果为认识glgB基因信息和发菜响应干旱胁迫的糖原代谢和调控机制提供了依据。

钙对苹果果实过氧化物酶、β-1,3-葡聚糖合成酶和β-1,3-葡聚糖分解酶活性的影响

采用贮藏实验与果实薄片培养实验相结合的方法,研究了钙素对苹果果实β-1,3-葡聚糖合成酶、β-1,3-葡聚糖分解酶和过氧化物酶(POD)的活性及对丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,与对照比较,幼果期喷钙显著降低了苹果苦痘病发病率, POD和β-1,3-葡聚糖合成酶的活性增加,β-1,3-葡聚糖分解酶活性和MDA含量降低;果实薄片培养中,与低钙处理比较,高钙处理POD和β-1,3-葡聚糖合成酶的活性增加,β-1,3-葡聚糖分解酶活性和MDA含量下降。说明苹果果实生理变化与钙素营养关系密切,果实钙营养不足导致氧自由基清除能力下降和细胞壁分解加快,是缺钙导致苹果果实生理失调的主要原因。

β-1,4-葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中分泌表达

采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81 bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657 bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36e-usp45-egl3及重组大肠杆菌E.coli DH5α/pMG36e-usp45-egl3。分析重组大肠杆菌的表达效果及表达产物降解纤维素的能力。结果表明,重组大肠杆菌DH5α/pMG36e-usp45-egl3经14 h培养能分泌酶活为226 mU/mL的β-1,4-葡聚糖内切酶,并有效地降解了羧甲基纤维素钠。其中分泌的β-1,4-葡聚糖内切酶降解羧甲基纤维素钠生成还原糖的速率为2.35 mg/(h·mL)。

基于数据挖掘模型分析1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP联合检测对艾滋病合并肺孢子菌肺炎的诊断价值

目的:探讨1-3-β-D葡聚糖、乳酸脱氢酶(LDH)、CD4^(+)T淋巴细胞、C反应蛋白(CRP)联合检测对艾滋病(AIDS)合并肺孢子菌肺炎(PCP)的诊断价值。方法:选取2016年4月至2022年2月于温州市第六人民医院收治的315例艾滋病患者为研究对象,其中170例合并PCP患者为研究组(AIDS/PCP组),145例肺部无感染患者为对照组(AIDS组)。检测两组患者1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP水平,构建多层感知器(MLP)神经网络模型、卡方自动交互检测(CHAID)决策树模型、Logistic回归模型,通过受试者工作特征(ROC)曲线评估1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP联合检测对AIDS合并PCP的诊断效能。结果:AIDS/PCP组的1-3-β-D葡聚糖、LDH、CRP水平显著高于AIDS组,CD4^(+)T淋巴细胞计数显著低于AIDS组,差异均有统计学意义(P<0.001);构建的MLP神经网络模型1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP联合检测诊断AIDS合并PCP的特异度、敏感度、准确率分别为88.97%、86.47%、87.62%,ROC曲线下面积(AUC)为0.942;CHAID决策树模型特异度、敏感度、准确率分别为70.34%、84.12%、77.78%,AUC为0.871;Logistic回归模型特异度、敏感度、准确率分别为89.66%、84.71%、86.98%,AUC为0.939。结论:MLP神经网络模型联合1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP检测对AIDS合并PCP具有良好的辅助诊断价值。

培养基组分对纤维杆菌X4-9发酵产纤维素酶的影响

考察发酵培养基组分对纤维杆菌X4-9发酵产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的影响。应用DPS软件的二次回归旋转中心组合实验设计方法,对纤维杆菌X4-9的发酵培养基(花生秸秆粉、蔗糖、尿素、(NH4)2SO4、硫酸镁、磷酸二氢钾)进行了优化。结果表明:在试验数值范围内,花生秸秆粉、蔗糖和(NH4)2SO4对酶活均会产生极显著的正效应,而尿素、硫酸镁和磷酸二氢钾的用量则具有明显的负效应;在优化的发酵培养基配方(花生秸秆粉30g/L、蔗糖20g/L、尿素2.5g/L、(NH4)2SO410g/L)下,葡萄糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分别达到2.705163,5.723014,3.614921IU/mL,比初始发酵培养基配方下的各酶活分别提高了123.66%,146.32%和186.40%。纤维杆菌X4-9均能同时产生葡萄糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶等纤维素降解复合酶系,且这些酶高产的培养基条件较为一致。

干血滤纸片和白细胞酸性α-葡萄糖苷酶活性测定平台的建立及临床应用

目的建立干血滤纸片和白细胞酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）活性测定方法及正常参考值，用于糖原累积病Ⅱ型（GSDⅡ患者的酶学诊断。方法利用GAA特异性水解荧光底物4-MUG的原理，采用阿卡波糖抑制其同工酶，建立干血滤纸片（DBS）和白细胞测定GAA活性方法。取700例DBS样本和100例白细胞样本作为正常对照建立DBS和白细胞测定GAA活性正常参考值，并对临床疑诊4例患者及其父母进行GAA活性测定。结果DBS法具有良好的精密度，室温或低于室温保存至少4周对DBSGAA活性无明显影响。正常新生儿和儿童-成人DBS的GAA参考范围分别为8．92～60．03pmol／（punch·h）和8．00～37．43pmol／（punch·h）；正常人白细胞GAA参考范围：12．56～50．26nmol／（mg蛋白·h），共检出4例GSDⅡ型患者。结论DBS法测定GAA活性具有敏感、快速、高通量等特点，适于GSDⅡ型高危人群筛查和诊断；白细胞法测定GAA活性也具有快速、特异性高等特点，适于患者的确诊。

木薯酒精废水高温厌氧消化系统中酶的提取与分布的研究

木薯酒精废水中固形物(干基)的主要成分为纤维素和半纤维素,分别为30%和18%。由于内切-β-1,4-葡聚糖苷酶(CMC酶)和木聚糖酶在高温厌氧消化过程中对纤维素和半纤维素的水解起关键作用,作者比较了从厌氧污泥中提取CMC酶和木聚糖酶的6种方法,并分析了其在厌氧污泥中的分布情况。结果表明,用质量分数1% Triton X-100来提取CMC酶和木聚糖素酶是一种高效且温和的酶提取方法,且至少有占总酶质量90%的CMC酶和70%的木聚糖酶分布在污泥絮凝体(细胞表面或胞外聚合物)中。

N-对氯苯磺酰基-4-氨基水杨酸抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用

本研究旨在探讨N-对氯苯磺酰基-4-氨基水杨酸对葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的溃疡性结肠炎的治疗作用。将60只BALB/c小鼠随机分为空白组、DSS模型组、5-氨基水杨酸(5-amino salicylic acid, 5-ASA)组、给药组,每组10只,空白组正常饮水,其他各组均饮用质量浓度(w/v)为0.04的DSS, 5-ASA组(40 mg·kg^(-1))、N-对氯苯磺酰基-4-氨基水杨酸(10、20、40mg·kg^(-1))采用灌胃给药方式。实验期间每日测量小鼠体重,观察各组小鼠大便形态(大便是否成形)和肉眼血便情况以及精神状态等。建模10天,取血后处死小鼠,解剖并摘取重要脏器以及结肠组织,称取脏器重量,测量结肠长度。通过苏木精-伊红(hematoxylinand eosin,HE)染色对各组小鼠的重要脏器(心、肝、肺、肾)和结肠组织进行病理学评分。通过ELISA检测血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素1(interleukin 1 beta, IL-1)、白细胞介素6(interleukin6,IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白2(macrophageinflammatoryprotein2,MIP-2)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)等炎症因子的表达。实验结果显示,建模第4天, DSS模型组小鼠出现便血的情况,第7日模型组便血小鼠数量上升至10只,造模后5-ASA组及给药组小鼠出现便血和腹泻。DSS模型组小鼠从建模第4天起出现精神状态差,体重下降明显,给药组和5-ASA组小鼠精神状态较好,体重接近于空白组小鼠(P <0.01)。给药组的结肠长度明显大于DSS模型组。HE染色结果显示, DSS模型组小鼠结肠黏膜层出现重度炎症细胞浸润,局部出现不同程度的坏死,坏死处已有成纤维细胞增生,黏膜肌层组织出现炎症细胞浸润;中剂量组(20mg·kg^(-1))结肠黏膜表现为轻度慢性炎症和少量炎性细胞浸润,情况略有改善;高剂量组(40mg·kg^(-1))小鼠结肠黏膜结构基本恢复正常,上皮结构较完整,少量炎症细胞浸润。ELISA结果显示,给药组小鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2及MPO的含量较模型组显著降低。因此可以得出, N-对氯苯磺酰基-4-氨基水杨酸有治疗DSS诱导UC模型的作用。

以痛风肌炎为临床表现的糖原累积症三例及文献复习

目的：探讨糖原累积症的临床特征、诊断和鉴别诊断。方法：分析3例糖原累积症患者的临床表现、实验室检查、影像学以及病理活检结果并进行相关文献复习。结果：3例患者中男性1例,女性2例,年龄21～37岁,平均27岁;病程0.5～22年,其中1例表现为继发性痛风,2例类似多肌炎;2例患者有高尿酸血症、高脂血症和肝肿大,肝活检显示脂肪变性和糖原累积;1例患者有心脏传导阻滞、突发性呼吸衰竭和明确家族史,α-1,4糖苷酶活性检测显著低于正常值,血乳酸水平显著高于正常值上限,肌肉活检糖原染色阳性。结论：糖原累积症主要症状群中包括关节肌肉方面的表现,对于一些初诊为痛风或炎性肌病的非寻常患者,应仔细了解家族史,并对血液、活检标本等行相关特异性检查,如特定酶的活性测定和糖原染色等以免误诊。

糖原累积病Ⅳ型的临床和病理特点

目的报道1例22岁男性糖原累积病Ⅳ型（Anderson disease）患者临床及病理特点。方法对该患者行详细的病史询问和体格检查、心脏和腹部超声检查、头颅影像学、肌电图以及肌肉病理检查。结果患者儿童期发病，主要表现为四肢近端肌肉运动不耐受和疲劳感，偶有心悸；腹部超声示肝硬化、门脉高压和巨脾，超声心动图示心肌肥大、二尖瓣和三尖瓣轻度关闭不全；四肢骨骼肌肌电图示肌源性损害。头颅影像正常。肌肉病理HE染色示肌纤维内大量嗜碱性物质沉积，沉积物糖原染色（PAS）染色呈强阳性，淀粉酶处理后部分阳性物质被消化。电镜下嗜碱性沉积物为分支状细丝样结构以及无定型的颗粒样物质。结论此例为国内首次报告的糖原累积病Ⅳ型，属于分支酶缺陷病，受累组织和器官以骨骼肌、肝脏、脾脏和心肌为主。

伴有肥厚性心肌病的晚发型糖原贮积症Ⅱ型三例临床和基因突变分析

目的分析伴有肥厚性心肌病的晚发型糖原贮积症Ⅱ型的临床和基因突变特点。方法对2011-2016年上海交通大学医学院附属新华医院小儿内分泌／遗传门诊就诊的3例晚发型糖原贮积症Ⅱ型患儿，分析其临床和实验室特点，干血滤纸片法检测其葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶（GAA）活性，PCR产物直接测序法进行GAA基因突变的检测。对所发现的5种突变构建突变型GAA质粒，将野生型质粒与突变型质粒瞬时转染293T细胞，测定突变型及野生型GAA活性，westernblot检测野生型及突变型GAA蛋白在293T细胞中的表达并进行统计学分析。结果3例患儿分别在3岁或1岁6个月出现运动发育迟缓、肌无力伴肥厚性心肌病，其酸性GAA活性分别为2．65、3．55和1．51pmol／（punch·h）（正常对照8．00-98．02）。GAA基因分析发现3例患儿携带5种致病突变（P．G478R，P．P361L，P．P266S，P．Q323x，p．R672Q）。结合临床3例患儿诊断为晚发型糖原贮积症Ⅱ型。对所发现的5种突变进行体外表达和功能研究，发现5种突变型酶活性只有野生型酶活性的9．9％～22．5％，5种突变型的蛋白表达量与野生型相比，只有野生型的32．0％～63．9％。结论3例晚发型糖原贮积症Ⅱ型患儿，临床表现为四肢肌无力，均有明显的肥厚性心肌病，心功能尚处于代偿期。共发现5种GAA基因致病突变，5种突变均可导致GAA活性降低和蛋白表达量下降。