樟树4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的克隆及表达分析

4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK)是植物萜类化合物生物合成途径甲基赤藓醇-4-磷酸途径(methylerythritol-4-phosphate pathway,DXP/MEP)上的第4个关键酶。该研究根据樟树转录组数据,利用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从药用植物樟树Cinnamomum camphora中克隆得到4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因,命名为Cc CMK1(Gene Bank登录号Ku376098),对其序列进行生物信息学分析,结果表明该基因开放阅读框(ORF)为1 212 bp,编码403个氨基酸,推测其相对分子质量为44.46 k Da,等电点(theoretical p I)为4.99。跨膜结构分析表明CMK蛋白不存在跨膜结构。信号肽分析表明其为非分泌蛋白,不存在信号肽。亚细胞定位表明其定位于叶绿体中。利用荧光实时PCR检测了龙脑樟、油樟、芳樟、脑樟和异樟5种化学型樟树中Cc CMK1基因的表达量,结果表明Cc CMK1基因在油樟中的表达量最高,龙脑樟中表达量最低,为樟树萜类化合物生物合成途径关键酶基因元件挖掘提供研究基础。

雷公藤4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析

4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-（cytidine-5-diphospho）-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK]是雷公藤甲素等萜类成分生物合成途径上关键酶之一。根据获得的雷公藤转录组数据中Tw CMK片段设计特异性引物,采用全长PCR方法克隆Tw CMK全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测茉莉酸甲酯（Me JA）诱导雷公藤悬浮细胞后0~72 h Tw CMK基因的表达水平。结果表明,Tw CMK全长c DNA由1 732个核苷酸组成,具有完整的开放阅读框,共编码387个氨基酸,蛋白相对分子质量为42.85 k Da,理论等电点为5.79;Tw CMK基因受Me JA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。为进一步研究雷公藤甲素等萜类成分次生代谢调控和生物合成奠定了基础。

胡黄连2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因的生物信息学分析

目的研究胡黄连Picrorhiza kurrooa 2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶(MCT)基因特征并预测MCT结构与功能位点。方法以胡黄连MCT基因为研究对象,利用NCBI网站及生物信息学软件对其碱基分布、氨基酸组成、亲疏水性、保守区及二级结构和三级结构进行预测和分析;并对9个物种的MCT基因进行多重比对与进化分析。结果胡黄连MCT基因的mRNA序列长为1 216 bp(GenBank JQ991625.1),编码由399个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质相对分子质量为44 448.5,其中量最高的为Ser(10.0%);整个多肽中疏水性氨基酸占59.5%,平均疏水值为0.050;与丹参Salvia miltiorrhiza MCT氨基酸序列对比同源性最高,达99%。结论胡黄连MCT基因处于稳定状态,编码的蛋白为疏水性蛋白,在进化过程中是相对保守的,获得的保守区段序列信息为其他物种MCT基因的克隆奠定了基础。

滇龙胆GrCMS基因的克隆与表达分析

2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶是赤藓糖磷酸酯(MEP)途径中的第三个催化酶。以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因GrCMS,并进行原核表达和组织特异性表达分析。序列分析显示,GrCMS基因(登录号KJ917164)开放阅读框(ORF)长933 bp,编码310氨基酸,推测分子量为34.23 kD,等电点为7.68。蛋白质序列分析显示,GrCMS无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,可能定位叶绿体;具有CMS保守结构域。进化分析结果表明,GrCMS蛋白与长春花CrCMS蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,GrCMS与预期蛋白大小一致。定量PCR结果表明,GrCMS基因主要在叶中表达。结果为进一步研究该基因功能和龙胆苦苷生物合成途径奠定基础。

茅苍术AlCMK基因的克隆及原核表达分析

4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-(cytidine-5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK]是生成萜类化合物MEP途径的关键酶之一。本研究以茅苍术转录组数据为依据,克隆获得CMK基因序列,命名为AlCMK(GenBank登录号为OM283293)。研究结果表明,AlCMK包含一个全长为1230 bp的开放阅读框(ORF),编码409个氨基酸,推测其相对分子质量为44752.53,蛋白理论等电点为6.67;跨膜结构分析表明其无跨膜结构,二级结构显示其主要由无规则卷曲(48.17%)结构组成;同源氨基酸序列分析表明,茅苍术与除虫菊、桂花、杜仲、忍冬、丹参CMK基因编码的氨基酸序列具有较高同源性;系统进化树分析表明,茅苍术AlCMK与菊科植物CMK蛋白亲缘关系较近;构建pET-32a-AlCMK原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态,蛋白表达结果显示其分子质量约为65 kDa;利用qRT-PCR分析AlCMK基因在不同组织和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的表达模式,同时采用ELISA试剂盒法测定茅苍术CMK酶活性,结果表明,不同产地茅苍术AlCMK基因具有组织表达差异性,且受外源MeJA诱导表达,酶活结果显示不同产地茅苍术CMK酶活性均在叶中较高;亚细胞定位显示该基因位于叶绿体中。本研究为进一步阐明茅苍术中萜类化合物合成途径AlCMK基因的生物学功能提供参考。