重组E.coli CCZU-K14高效合成(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯研究

为了避免在反应过程中加入昂贵的辅酶因子NAD+及有效地转化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-3-羟基-4-氯丁酸乙酯((S)-CHBE),在水相反应体系中加入L-谷氨酰胺(200mmol/L)以提高重组E.coli CCZU-K14细胞内NADH的浓度以及催化活性。当与不添加L-谷氨酰胺相比,添加L-谷氨酰胺后催化活性提高了1.1倍。进一步,在含L-谷氨酰胺(200mmol/L)反应体系中加入了β-环糊精(n(β-环糊精)∶n(COBE)=0.4∶1)。与不添加β-环糊精相比,添加β-环糊精后E.coli CCZU-K14催化活性提高了1.35倍。在L-谷氨酰胺-β-环糊精-水反应体系中,催化还原3 000mmol/L COBE反应12h,(S)-CHBE(>99%e.e.)的产率达到94.9%。总之,研究结果为生物催化不对称高效合成(S)-CHBE工业化生产奠定了基础。

重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用.

水/有机溶剂两相体系微生物催化不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

研究了水/有机溶剂两相体系中,出芽短梗霉SW0202细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)的过程。有机溶剂的选择表明邻苯二甲酸二丁酯为该反应最适有机溶剂,与单一水相体系相比,水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系能明显改善反应效率。通过系统考察一些因素如相体积比、振摇速度、反应温度和pH等对反应速度、摩尔转化率和产物光学纯度的影响发现,这些因素对还原反应的初速度和摩尔转化率有较明显的影响,而对产物的光学纯度影响不明显。优化后的条件为:水与有机溶剂的相体积比1:1,振摇速度180r·min-1,温度30℃,pH7.0。在该优化反应条件下,水/有机溶剂两相体系中出芽短梗霉SW0202细胞催化COBE生成(S)-CHBE不对称还原反应的最大摩尔转化率和产物的光学纯度分别达到了94.8%和97.9%e.e.,在用Na2CO3溶液控制水相pH7.0条件下,有机相中的产物浓度积累达58.2g·L-1。

水／离子液体两相体系中出芽短梗霉催化4-氯-乙酰乙酸乙酯不对称还原合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯

考察了水/离子液体两相体系中出芽短梗霉(Aureobasidium pullulansCGMCC1244)催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原生成光学活性(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)的性能,并对反应条件如摇床转速、相体积比、温度、初始底物浓度和pH值等进行了优化.结果表明,在水/1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐体系中,出芽短梗霉催化COBE不对称还原生成(S)-CHBE,在30℃,pH6·6,摇床转速180r/min和不对称反应8h条件下,反应物的转化率、产物ee值和浓度分别达到95·6%,98·5%和47·1g/L.在控制pH值为6·6的情况下,通过分添加底物可有效提高产物(S)-CHBE浓度至75·1g/L.

生物催化不对称还原方法生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

通过筛选得到不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)对映选择性好的微生物菌株出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)SW0202.对其还原反应条件进行优化,得到最佳转化条件为:初始细胞浓度0.32g/mL(以湿菌体计),底物浓度20g/L,pH7.0,温度30℃.在此优化条件下,产物浓度达20.32g/L,摩尔转化率为79.6%,产物对映体过量值e.e.为97.8%.分批添加底物可显著减小底物的抑制作用.

酵母发酵液直接催化4-氯-乙酰乙酸乙酯不对称还原生成4-氯-3-羟基-丁酸乙酯

考察了面包酵母发酵液直接催化4-氯-乙酰乙酸乙酯（COBE）的不对称还原反应,并进行了手性添加物的筛选和反应条件的优化实验. 结果表明,以β-环糊精为手性添加物时,酵母发酵液催化COBE不对称还原生成光活性产物（S）-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯（（S）-CHBE）的产率和ee值分别高达76%和92%. 在一定条件下,增大β-环糊精浓度,有利于（S）-CHBE的生成. 最佳酵母菌培养时间为16～18 h, 最佳反应温度和pH值分别为29～31 ℃和7.2.

重组菌转化4-氯乙酰乙酸乙酯为R-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

通过醛基还原酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因构建重组大肠杆菌,并考察加入诱导剂的时间、浓度和诱导时间对酶活的影响,优化重组大肠杆菌的表达。实验结果表明,重组大肠杆菌在对数生长中期加入0.4 mmol/L的诱导剂,在32℃下培养8 h,酶活可达到5.27 U/mg-protein。以重组大肠杆菌为催化剂,研究4-氯乙酰乙酸乙酯转化为-R(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的反应,发现利用基因重组技术构建的大肠杆菌,可使醛基还原酶和葡萄糖脱氢酶共同表达,实现辅酶再生,提高产物对映体过量值。在转化反应过程中,随着温度升高,产物收率先增加;当转化温度在32℃以上,收率反而会下降。底物对反应有抑制作用,采用分批加入底物的方式可以减少抑制作用,提高产物收率。

Bacillus megaterium WZ009催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯

以外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯为唯一C源的富集培养筛选得到一株菌株WZ009,经16S rDNA测序鉴定为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)。B.megaterium WZ009静息细胞可以立体选择性催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯水解和脱氯反应得到光学纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(e.e.≥99%)和(S)-3-羟基-γ-丁内酯(e.e.≥95%)。笔者对B.megaterium WZ009不对称催化反应影响因素(温度、pH、中和剂、底物浓度、时间进程以及细胞重复利用)进行优化研究,确定了该反应体系最优条件:底物浓度200 mmol/L,中和剂氨水,pH 7.2,40℃反应12 h,转化率达到50.6%,底物对映体过量值为99.6%。该生物催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯过程具有良好的工业化应用前景。

面包酵母催化不对称合成4-氯-(R)-3-羟基丁酸乙酯

以4 氯乙酰乙酸乙酯为原料,以面包酵母为手性生物催化剂,选择性合成光学活性4 氯 (R) 3 羟基丁酸乙酯。经IR、GC MS、1HNMR和旋光度测定,表明所得产品的结构与预期的结构一致。分别考察了面包酵母用量、葡萄糖浓度、底物投入量、pH值、反应时间以及反应温度等因素对产品比旋光度的影响。结果表明,4 氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的适宜条件为:面包酵母6 0 0g/L、葡萄糖2 0g/L、反应温度34℃、底物加量16mL/L、反应时间4 8h、pH为5 ,产品的比旋光度为[α]2 0D =+13 9°。

外消旋体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的化学合成

采用化学方法,从4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)出发,合成得到4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE),收率为82.5%、纯度达96.779%,并对合成产物的结构进行了表征。

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成

报道了用4 氯 乙酰乙酸乙酯为原料,以面包酵母为还原剂,选择性合成(s) 4 氯 3 羟基丁酸乙酯。分别考察了能源供体、蔗糖浓度、反应温度、底物加量和压榨酵母用量等因素对产物收率和对映体过量值的影响。结果表明,4 氯 乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的适宜条件为:能源供体40.0g/L蔗糖,反应温度36.5℃,压榨酵母50.0g/L,底物加量12.0g/L,pH为7 0。反应收率可达60 5%,ee收率为98 5%。

GC-MS法测定左乙拉西坦中的基因毒性杂质4-氯丁酸甲酯和4-氯丁酸乙酯

目的:建立一种气质联用色谱检测左乙拉西坦中基因毒性杂质4-氯丁酸甲酯和4-氯丁酸乙酯含量mL·min-1;进样方式用分流进样,分流比2∶1;载气为氦气;检测器为质谱检测器;离子化方式为EI;溶剂延甲酯和4-氯丁酸乙酯的检测;4-氯丁酸甲酯和4-氯丁酸乙酯在一定范围内线性良好,r均大于0.990 0;定量下限分别为0.979 7、1.789 ng·mL^-1;加样回收率良好,平均加样回收率(n=12)分别为93.9%,90.9%;RSD灵敏度高,专属性和准确度好,可用于左乙拉西坦中4-氯丁酸甲酯和4-氯丁酸乙酯检测。

有机相酶催化氨解反应拆分制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

通过脂肪酶催化的氨解反应拆分4-氯-3-羟基丁酸乙酯.经过对脂肪酶及反应溶剂的筛选,确定最佳脂肪酶及溶剂分别为Novozym435和二氧六环;并在该反应体系中考察了温度、底物浓度、酶浓度与摇床转速对反应的影响.综合考虑反应的反应速度和对映体选择率,确定较佳的反应条件为:温度30℃、底物浓度0.5mol/L、酶量10mg/mL、摇床转速200n/min.反应35h后,ee可以达到99%以上,此时转化率为57.7%.

酵母发酵液催化不对称还原反应合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的条件优化

目的优化酵母发酵液直接催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯((S)-CHBE)的反应条件.方法考察酵母发酵液催化该反应过程中基质变化的规律,研究底物和能源供体对反应的影响,并通过正交实验设计法优化反应条件.结果在酵母发酵液催化COBE不对称还原反应的过程中,底物和还原糖消耗、产物合成相对集中在反应的前期;反复分批式添加底物和蔗糖有利于反应效率的提高;正交实验优化反应条件的结果表明酵母发酵液直接催化COBE不对称还原反应合成(S)-CHBE的最佳反应条件为蔗糖添加方式Ⅱ(反应开始2h后添加5g/120mL),底物添加方式Ⅳ[0.5(3)],缓冲剂添加量2g/120mL,β-环糊精添加量为2g/120mL,反应后测定产物的产率达96%,ee(对映体过量值)达100%.结论通过反应条件优化提高了酵母发酵液的催化效果.

交联醇脱氢酶聚集体的制备及其在(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用

基于基因组序列数据库挖掘新酶的技术,从白色念珠菌Candida albicans基因组中克隆了一条新型醇脱氢酶(CADH)基因,并在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中表达。为克服游离酶稳定性差、不能重复使用的缺点,探索并优化了交联醇脱氢酶聚集体(CLEAs-CA)的制备条件。结果表明:重组CADH对底物四氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的比活力为1.8 U/mg,产物(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)的对映体过量值大于99%。CLEAsCA沉淀剂选择为60%饱和度的(NH_4)_2SO_4,交联剂为10 mmol/L戊二醛。在固定化操作前,加入50 mmol/L异丙醇和0.1 mmol/L NAD^+对CADH催化活性位点、辅酶结合位点进行保护,CLEAs-CA的活力回收率提高了48.3%。将CLEAs-CA用于不对称合成(R)-CHBE,经过19次的重复使用,CLEAs-CA的活性仍保留有50%。

酶法合成阿托伐他汀侧链中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究进展

第三代羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂——阿托伐他汀是年销售额超过百亿的重磅降血脂药物,因其疗效显著而广受医生患者好评。阿托伐他汀主要通过疏水性母核及手性侧链进行合成,而手性侧链的制备是合成关键。目前,生物催化技术在手性药物合成中的应用备受关注,而阿托伐他汀手性侧链中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酶法合成也成为研究热点。本文主要介绍近年酶法合成在(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的研究进展。

水/有机溶剂双相酶偶联体系不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

酶分子经济性是评估单位酶催化剂分子催化效率的常数,其定义为单位酶活力催化的时空产率,即比时空产率。本研究以模式底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为研究目标,系统考察了底、产物对参与催化反应的羰基还原酶(CR2)及葡萄糖脱氢酶(GDH)各自酶活力的毒害及抑制作用,对此从17种有机溶剂中筛选较适合该体系的有机溶剂-邻苯二甲酸二丁酯,进一步确定水/有机双相最佳反应比例为1:1。在此基础上,采用先单水相后双相的反应形式,结合底物补料策略将底物浓度提高至300 mmol/L,反应6 h后产物得率高达97.4%,光学纯度大于99.9%e.e.,有机相中产物浓度达到475 mmol/L,比时空产率达到16.2 mmol/L·h·U,相比于所报道的酶偶联体系,本研究构建的双相体系具有较好的酶分子经济性。

手性医药中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的气相色谱分析

采用气相色谱法测定4-氯乙酰乙酸乙酯不对称催化还原手性4-氯-3-羟基丁酸乙酯反应体系中相关组分的含量。选择手性色谱柱及1,3-丁二醇内标物为色谱条件，在此条件下各种物质能很好地分离，该方法的检出限为10.24-19.56 mg·L-1，相对标准偏差为0.42%-0.68%，加标回收率为97.7%-101.3%，其精密度和准确度均能满足常规分析要求。

4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]哌嗪-3-甲酸乙酯的合成

以4-氯-3-氧代丁酸乙酯为原料,经与叔丁醇钾醚化、DMF-DMA缩合、水合肼环合、脱叔丁基、羟基氧化、还原氨化、分子内环合以及氢化脱苄等反应合成了标题化合物。并对其中关键的羟基氧化反应和分子内环化反应的工艺条件进行了优化,获得了较优的工艺条件:在羟基氧化反应中以二氧化锰为氧化剂、氯仿为溶剂;在分子内环化反应中以甲基磺酰氧基(OMs)为离去基团。目标化合物的总收率为39.5%,其结构经~1HNMR、^(13)CNMR、MS和元素分析进行了确定。