杜仲2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶基因全长cDNA克隆与序列分析

2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶（MDS）基因曾被认为是调控植物2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径的一个关键节点.为解析杜仲MDS基因序列信息和预测基因功能,以叶片cDNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）及cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离出杜仲MDS基因的cDNA克隆,并通过一系列生物信息学方法进行序列分析.结果表明：EuMDS基因cDNA全长976 bp,5＇端非编码区长119 bp,3＇端非编码区长146bp,编码236个氨基酸.推导EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列（A1～A56）以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点（A84,A87,A89,A121,A213,A217,A221,A223,A228）.推导EuMDS蛋白二级结构中α-螺旋占40.3％,β-折叠占13.6％,螺环结构占46.2％.推导EuMDS蛋白三级结构由3个亚单位组成,并相互围绕形成1个分子内腔.系统进化分析表明EuMDS蛋白与啤酒花MDS蛋白亲缘关系最为接近.预测所克隆的EuMDS基因在杜仲萜类生物合成中发挥重要功能.

丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析。方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平。结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值。结论:从丹参毛状根中克隆得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因。

链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠肾脏COX-2/PGE2/EPs的表达

【目的】探讨链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠肾脏COX-2/PGE2/EPs的表达情况。【方法】多次小剂量腹腔注射STZ诱导1型糖尿病小鼠模型,实验分为两组:正常对照组(NC)和糖尿病组(DM)。ELISA法检测血清和尿液中前列腺素E2(PGE2)的表达水平;RT-q PCR法检测肾组织环氧合酶-2(COX-2)、膜结合型前列腺素E2合成酶-1(m PGES-1)、各型EP受体(EP1、EP2、EP3、EP4)的m RNA表达水平;Westernblot法检测相应蛋白表达水平。【结果】随着周龄增加,DM组小鼠逐渐出现明显多饮、多尿、体质量下降等糖尿病消耗症状;与NC组小鼠相比,DM组小鼠空腹血糖(FBG)和24 h尿蛋白排泄量均显著增加(P<0.05);肾脏COX-2和EP4表达水平明显上调(P<0.05)、而m PGES-1、EP1、EP2、EP3 m RNA表达无显著变化(P>0.05);同时,DM组小鼠24 h尿PGE2定量显著高于NC组(P<0.05)。【结论】1型糖尿病小鼠肾脏组织中,早期即可检测到COX-2和EP4表达上调,伴24 h尿PGE2定量增加,提示COX-2/PGE2/EP4信号轴激活可能参与了糖尿病肾病的发生发展。

银杏MECPs基因启动子克隆及其植物表达载体的构建

为深入研究银杏MECPs基因启动子的结构及功能特点,以前期获得的银杏MECPs基因的cDNA序列为模板,采用染色体步移技术(Genome Walking),从银杏基因组中扩增到一段GbMECPs基因启动子序列。结果表明:该启动子片段长度约为744bp,含有多个基本顺式作用元件TATA和CAAT-box及典型的光调节元件GT-1motif(GRWAAW)和Circadian box(CAANNNNATC)等。进一步分析发现,该调控序列还包含多个对生长素、赤霉素、乙烯利、细胞分裂素、脱落酸等各种激素应答相关的调控元件和MYB、MYC转录因子介导的多种逆境胁迫诱导元件。将克隆的GbMECPs启动子替换质粒pBI121中的35S启动子,成功构建了由GbMECPs启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体pBI121+GbMECPs。

芒果MDS家族基因的鉴定、进化及表达分析

2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MDS)是MEP代谢途径中的关键酶。为了鉴定芒果中的MDS家族基因,探索MDS家族基因的进化、表达模式。本研究采用同源搜索的方法,从13个植物基因组中下载了16个MDS家族基因,对其进行了蛋白结构域、系统发育及在芒果中的表达分析。蛋白结构域分析结果显示,芒果MDS家族基因的蛋白序列均包含完整的PF02542.16结构域。系统发育进化树显示,芒果中的MDS家族基因是在双子叶植物形成后进化的,且与柑橘的MDS基因关系最近。表达分析结果显示,在芒果品种‘贵妃’、‘台农’和‘金煌’的成熟果果肉中,芒果MDS家族基因均在‘贵妃’中表达量最高,其次是‘台农’,在‘金煌’中表达量最低,而且差异显著。本研究为进一步研究芒果MDS家族基因在萜类合成途径中的作用提供科学依据。

药用植物质量标志物多糖生物合成通路及关键酶研究进展

多糖是众多药用植物中重要的质量标志物,在免疫调节、抗肿瘤等方面具有显著的药理作用。多糖是一类结构复杂、种类繁多、组合多样的生物大分子,其生物合成通路主要包括蔗糖转化、尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖至其他NDP单糖的转化、多糖聚合3个部分。在这一合成过程中涉及的关键酶主要包括蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)、果糖-6磷酸酯在蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)、蔗糖由转化酶(invertase,INV)、己糖激酶(hexokinase,HK)、果糖激酶(fructokinase,FRK)、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)、UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)、磷酸甘露糖突变酶(phosphomannose isomerase,PMM)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMPP)、糖基转移酶(glycosyl transferases,GTs)等。选取以多糖为主要质量标志物的药用植物为探讨对象,对其多糖生物合成通路、关键酶作用机制及单糖组成进行归纳分析,并对研究中存在的问题和可能的解决思路进行了梳理和展望。对明确药用植物质量标志物多糖生物合成通路,了解关键酶作用机制具有一定的参考价值。

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究。方法根据黄花蒿MCS(AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列。将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a(+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白。半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况。结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子。构建pET-21a(+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a(+)-MCS原核表达体系。AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低。结论克隆了AaMCS基因,建立pET-21a(+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础。