杜仲2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶基因全长cDNA克隆与序列分析

2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶（MDS）基因曾被认为是调控植物2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径的一个关键节点.为解析杜仲MDS基因序列信息和预测基因功能,以叶片cDNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）及cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离出杜仲MDS基因的cDNA克隆,并通过一系列生物信息学方法进行序列分析.结果表明：EuMDS基因cDNA全长976 bp,5＇端非编码区长119 bp,3＇端非编码区长146bp,编码236个氨基酸.推导EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列（A1～A56）以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点（A84,A87,A89,A121,A213,A217,A221,A223,A228）.推导EuMDS蛋白二级结构中α-螺旋占40.3％,β-折叠占13.6％,螺环结构占46.2％.推导EuMDS蛋白三级结构由3个亚单位组成,并相互围绕形成1个分子内腔.系统进化分析表明EuMDS蛋白与啤酒花MDS蛋白亲缘关系最为接近.预测所克隆的EuMDS基因在杜仲萜类生物合成中发挥重要功能.

5-苄基-4-叔丁基-2-苄亚氨基噻唑的合成及其对环氧合酶-2的抑制活性

5-苄基-4-叔丁基-2-氨基噻唑与芳香醛缩合制备了1 1种5-苄基-4-叔丁基-2-苄亚氨基噻唑.结构经1H NMR和元素分析确证,并用单晶X-射线衍射测定了化合物Ⅰc的晶体结构.化合物Ⅰc晶体属单斜晶系,空间群为P21/n,晶胞参数为:a=1.43753(11)nm,b=0.98665(8)nm,c=1.46565(12)nm,β=114.2560(10)°;Z=4,V=1.8953(3)nm3,Dc=1.349 g/cm3,F(000)=808,R1=0.0507,wR2=0.1163,S=1.03.体外筛选结果表明,化合物Ⅰb,Ⅰk在10μmol/L浓度下对COX-2的抑制率超过50%.

三氧化二砷诱导NB4细胞凋亡和环氧合酶-2基因表达研究

本研究探讨三氧化二砷(As2O3)诱导NB4细胞凋亡过程中线粒体膜电位的改变及环氧合酶-2的表达变化。利用免疫荧光显微镜、DNA电泳等观察As2O3诱导NB4细胞凋亡过程中NB4细胞的形态学改变,流式细胞术检测NB4细胞凋亡率及线粒体膜电位改变,Western blot分析环氧合酶-2的蛋白质表达水平变化。结果表明,经2μmol/L As2O3处理NB4细胞48小时后,荧光显微镜显示NB4细胞出现核致密浓染、染色质固缩及片断化断裂,甚至呈碎片状;提取DNA进行琼脂糖电泳显示典型DNA Ladder现象。流式细胞术分析发现,NB4细胞经3μmol/L As2O3处理48小时后细胞凋亡率为33.34%,As2O3浓度越高,NB4细胞凋亡率越高;以0.5、1、2、4及8μmol/L As2O3分别处理NB4细胞48小时后,线粒体膜电位分别下降12.8%、21.6%、66.9%、83.7%和83.8%;Western blot检测显示,环氧合酶-2在实验组的表达明显低于对照组,且随着As2O3浓度的升高,环氧合酶-2的表达逐渐降低,二者呈显著的负相关关系。结论 :As2O3能够有效诱导NB4细胞凋亡,且在一定浓度范围内具有量效关系;线粒体膜电位下降与As2O3诱导的NB4细胞凋亡有关;环氧合酶-2可能参与了As2O3诱导的NB4细胞凋亡过程。

环氧合酶-2抑制剂降低结肠癌细胞血管内皮生长因子表达的影响及机制

目的探讨选择性环氧合酶(COX)-2抑制剂celecoxib影响结肠癌HT-29细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的机制。方法体外培养结肠癌HT-29细胞,采用MTT法检测celecoxib对HT-29细胞增殖的影响。同时针对Sp1和Sp4进行RNA干扰,应用RT-PCR和Western印迹法联合检测celecoxib组和干扰组对HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF m RNA和蛋白表达的影响。结果随着药物浓度的增加(5、10、20、40和80μmol/L)和作用时间的延长(2、4、8、16和32 h),celecoxib对HT-29细胞的增殖具有显著抑制作用,在2、4、8、16和32 h时的半数抑制浓度(IC50)分别为40.36、33.15、31.67、30.94和31.54μmol/L。RT-PCR和Western印迹检测显示,celecoxib可显著降低HT-29细胞Sp1、Sp4和VEGF m RNA和蛋白的表达水平,同时经RNA干扰Sp1(Sp4)后,HT-29细胞Sp1(Sp4)和VEGF m RNA和蛋白的表达水平明显降低,但Sp4(Sp1)m RNA和蛋白表达变化不明显。结论 celecoxib可抑制结肠癌HT-29细胞增殖,其作用机制可能是通过下调Sp1和Sp4表达水平而降低结肠癌细胞中VEGF的表达水平。

罗非昔布类似物4-[4-(甲磺酰基)苯基]-3-环己基-2(5H)呋喃酮的合成

对环氧合酶 -2选择性抑制剂罗非昔布 (Rofecoxib)进行了结构修饰 ,以对甲磺酰基苯乙酮为原料 ,经过溴化得到溴酮 ,然后与环己基乙酸钠在室温下反应 ,得到环己基乙酸酯 ,后者在避光、碱存在下环合得到了新化合物 4 -[4 -(甲磺酰基 )苯基 ]-3 -环己基 -2 (5H)呋喃酮。目标产物结构经 IR和 1 H

同型半胱氨酸对核因子-κB活性及白三烯E_4和前列腺素E_2合成水平的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人结肠腺癌(Caco-2)细胞中白三烯E_4(LTE_4)、前列素E_2(PGE_2)合成水平和核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响。方法在Caco-2细胞中加入不同浓度(0、10、20、50μmol/L)Hcy作用不同时间(1、3、6 h),采用MTT法和检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,观察Hcy对Caco-2细胞生长活性的影响;通过检测Caco-2细胞跨膜电阻(TEER)和样品中荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)浓度,观察Hcy对Caco-2细胞通透性的影响;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定Caco-2细胞上清液中LTE_4和PGE_2合成水平;采用凝胶迁移实验(EMSA)测定Caco-2细胞中NF-κB活性变化。结果随Hcy作用时间延长及作用浓度增加,Caco-2细胞活性明显受到抑制;随Hcy作用浓度增加,Caco-2细胞TEER明显降低,FITC跨膜转运量明显增加,细胞上清液中LTE_4和PGE_2水平明显升高(P<0.05);Hcy(50μmol/L)处理组细胞中NF-κB活性增强,且呈时间依赖性(1、3、6 h)。结论 Hcy通过激活NF-κB信号通路,促进Caco-2细胞肠黏膜LTE_4和PGE_2合成,引起肠黏膜炎症损伤。

DLL4、COX-2和MMP-2在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的探讨Delta样配体4(DLL4)、环氧合酶-2(COX-2)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在不同乳腺癌分子亚型组织中的表达情况及意义。方法采用免疫组化SP法检测乳腺癌(Luminal A型41例,Luminal B型18例,HER-2过表达型22例,基底细胞样型19例)组织100例及癌旁组织40例中DLL4、COX-2和MMP-2的表达情况,并分析三者表达及与淋巴结转移的相关性。结果 DLL4、COX-2和MMP-2在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为73.0%、81.0%和93.0%,均明显高于癌旁组织(P<0.05)。在不同分子亚型乳腺癌组织中,DLL4、COX-2和MMP-2在HER-2过表达型乳腺癌组织中的阳性表达率分别为95.5%、100.0%和100.0%,在基底细胞样型乳腺癌组织中分别为89.5%、94.7%和100.0%,均高于Luminal A型和Luminal B型乳腺癌组织(P<0.05)。DLL4、COX-2和MMP-2在有淋巴结转移的乳腺癌组织中阳性表达率分别为88.7%、92.5%和96.2%,显著高于无淋巴结转移者的阳性表达率(P<0.05)。DLL4分别与COX-2、MMP-2表达呈正相关(r=0.215,P<0.05;r=0.435,P<0.05)。结论 DLL4、COX-2和MMP-2在基底细胞样型和HER-2过表达型乳腺癌组织中呈高表达,DLL4、COX-2和MMP-2共同参与乳腺癌的发生、发展及浸润转移,联合检测三者表达可评估乳腺癌的转移情况。

脂多糖及TOLL样受体4阻断剂对蜕膜细胞中孕激素受体、IL-1β及COX-2的影响

目的:研究脂多糖(LPS)或拮抗剂TOLL样受体4阻断剂(Toll-like receptor 4 antagonist,TLR4 mAb)作用于体外培养的蜕膜细胞后其孕激素受体(progesterone receptor,PR)、IL-1β及COX-2的表达改变,以探讨LPS及其拮抗剂对蜕膜细胞中PR的影响,以及PR与炎症因子之间的关系。方法:分离培养早孕人蜕膜细胞,将细胞培养至第4代时随机分为6组,对照组:仅加培养液。研究1组:加入终质量浓度为100 ng/mL的LPS。研究2组:加入终质量浓度为1μg/mL TLR4 mAb。研究3组:加入终质量浓度为3μg/mL TLR4 mAb。研究4组:终质量浓度为1μg/mLTLR4 mAb预处理24 h,再加入质量浓度为100 ng/mL的LPS。研究5组:终质量浓度为3μg/mL TLR4 mAb预处理24 h,再加入质量浓度为100 ng/mL的LPS。均培养24 h后,采用RT-PCR半定量技术检测蜕膜细胞中PR,IL-1β及COX-2mRNA的表达情况。结果:LPS使蜕膜细胞中PR mRNA的表达下调(P<0.05),使IL-1β和COX-2 mRNA的表达上调(P<0.05);TLR4 mAb则使LPS作用后的蜕膜细胞中PR mRNA的表达上调(P<0.05)、IL-1βmRNA的表达下调(P<0.05);高质量浓度TLR4 mAb使COX-2 mRNA的表达下调(P<0.05)。结论:LPS作用于体外培养的人蜕膜细胞后,PR mRNA表达下调;IL-1β,COX-2的mRNA表达增加;使用TLR4mAb后能拮抗LPS对蜕膜细胞中PR,IL-1β以及COX-2的作用。

前列腺癌患者外周血中CD4^+CD25^(high)调节性T细胞及调节因子TGF-β1和COX-2的表达

目的:通过检测前列腺癌患者以及健康志愿者外周血中CD4+CD25high调节性T细胞、TGF-β1及COX-2的表达,初步探讨CD4+CD25high调节性T细胞在前列腺癌发病机制中的作用及其与TGF-β1和COX-2的相关性。方法:应用流式细胞术检测30例前列腺癌患者治疗前后(其中前列腺癌局限组11例,非局限组19例)及20例健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+CD25high调节性T细胞占CD4+T细胞的比例;应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其外周血清中TGF-β1和COX-2的表达。对前列腺癌患者上述指标进行术前术后对比分析,另对CD4+CD25high调节性T细胞与TGF-β1及COX-2的相关性进行分析;并探讨上述指标在前列腺癌患者局限组和非局限组间是否存在差异性。结果:流式细胞术检测显示,前列腺癌患者治疗前PBMC中CD4+CD25high调节性T细胞占CD4+T细胞的比例为(18.32±7.49)%,高于健康志愿者对照组(7.77±1.86)%(P<0.05)。前列腺癌患者治疗后其比值为(17.34±5.87)%,较治疗前稍减低,但两者相比无显著差异(P>0.05)。ELISA检测外周血清中TGF-β1和COX-2显示,前列腺癌组分别为(215.97±55.16)ng/ml和(6.88±5.14)ng/ml,对照组分别为(149.75±47.11)ng/ml和(5.65±2.69)ng/ml;前列腺癌患者外周血清中TGF-β1的表达水平高于健康志愿者对照组(P<0.05),COX-2的表达水平与对照组无显著差异(P>0.05)。通过多重线性回归分析表明,前列腺癌患者PBMC中CD4+CD25high调节性T细胞的表达与血清中TGF-β1和COX-2的表达无显著相关。前列腺癌局限组和非局限组外周血中CD4+CD25high调节性T细胞、TGF-β1及COX-2的表达均无显著性差异(P>0.05)。结论:前列腺癌患者PBMC中CD4+CD25high调节性T细胞可能参与前列腺癌的发生,其增殖机制与血清中TGF-β1和COX-2的表达无关,可能与肿瘤本身及肿瘤局部微环境相关。

IL-4抑制COPD大鼠肺组织COX-2和PDGF的表达

目的探讨白细胞介素-4(IL-4)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型建立的影响,以及COPD肺组织中环氧合酶-2(COX-2)和血小板源性生长因子(PDGF)的表达及IL-4对其表达的影响机制。方法用雄性Wistar大鼠建立吸烟大鼠COPD模型。随机分为对照组,模型组,IL-4组和地塞米松组。用免疫组化法和逆转录聚合酶联反应法(RT-PCR),检测肺组织中COX-2和PDGF-A及PDGF-B的表达情况。结果模型组COX-2和PDGF-A、-B表达明显增高;IL-4组和地塞米松组显著降低。结论IL-4和地塞米松可干预COPD模型的建立;COPD肺组织中COX-2和PDGF的表达显著增高,IL-4和地塞米松可明显降低其表达。

IL-4下调COPD肺泡Ⅱ型上皮细胞中COX-2和PDGF的表达

目的:探讨COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)中环氧合酶-2(COX-2)及血小板源性生长因子(PDGF)的表达及IL-4对其表达的影响。方法:用雄性Wistar大鼠建立吸烟大鼠COPD模型后取整肺做原代培养,培养出肺泡Ⅱ型上皮细胞。随机分为对照组和模型组,并用IL-4干预模型组的肺泡Ⅱ型上皮细胞。用免疫组化法检测细胞爬片COX-2、PDGF-A及PDGF-B的表达。结果:模型组COX-2和PDGF-A、PDGF-B表达明显增高;IL-4干预组表达显著降低。结论:COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中COX-2和PDGF的表达显著增高,IL-4可降低其表达。

竹节参皂苷通过Toll样受体4/核因子-κB信号通路调控免疫功能对肺癌大鼠模型的影响

目的:研究竹节参皂苷对原发性肺癌的治疗作用以及对Toll样受体4(TRL4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的调控作用,阐明竹节参皂苷治疗原发性肺癌的作用机制。方法:大鼠灌注碘化油液诱导原发性肺癌模型。造模后1周,竹节参皂苷溶于生理盐水后灌胃给药,连续20周。观察大鼠的一般状态,计算肺癌肿瘤组织的体积和数量,ELISA测定炎症因子表达情况,流式细胞术测定CD 3^+、CD 4^+、CD 8^+免疫细胞数量,Western blot测定TRL4、NF-κB p65和环氧合酶2(COX2)蛋白表达情况。结果:竹节参皂苷可有效抑制肿瘤体积增大和数量增加,减少咳嗽频率,增加CD 3^+和CD 4^+免疫细胞数量,减少CD 8^+数量,抑制血清中炎症因子水平。Western blot结果表明,竹节参皂苷可有效抑制TRL4、NF-κB p65和COX2蛋白表达。结论:竹节参皂苷可有效抑制原发性肿瘤增生,其作用机制可能是通过抑制TRL4/NF-κB信号通路调节机体免疫反应,抑制炎症状态。

白头翁加味汤调节溃疡性结肠炎大鼠血清白介素-4和肠黏膜环氧合酶-2的研究

目的:观察白头翁加味汤对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠血清白介素-4(IL-4)以及肠黏膜环氧合酶-2(COX-2)的影响,探讨白头翁加味汤对UC的作用机理。方法:采用局部刺激法建立大鼠UC模型,将50只大鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组、白头翁加味汤高剂量组和低剂量组。造模后给药7 d,观察并计算疾病活动指数(DAI),检测各组大鼠血清IL-4以及肠黏膜COX-2。结果:与模型组相比,白头翁加味汤高、低剂量组DAI有明显改善(P<0.05),IL-4含量明显升高(P<0.05),COX-2含量明显降低(P<0.05)。结论:白头翁加味汤可能通过升高IL-4,减少COX-2的合成而减轻炎症反应,促进溃疡的愈合。

不同剂量活血、破血中药对动脉粥样硬化小鼠主动脉PTGS2、PADI4、ITGAM基因表达的影响

目的观察不同剂量活血中药(当归、川芎)、破血中药(三棱、莪术)对动脉粥样硬化(AS)小鼠主动脉环氧合酶-2(PTGS2)、肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PADI4)、ITGAM基因表达的影响。方法选取64只5周龄ApoE基因敲除小鼠随机分为6组,即模型对照组(模型组)、阿托伐他汀钙组(他汀组)、低剂量活血药组(低活血组)、低剂量破血药组(低破血组)、高剂量活血药组(高活血组)、高剂量破血药组(高破血组),制备AS模型。模型制备成功后,连续灌胃给药8周,模型组灌服等体积蒸馏水。选用RT-PCR检测主动脉组织PTGS2、PADI4及TTGAM基因mRNA表达并分析其结果。结果与模型组比较,各药物组均能显著下调PTGS2、PADI4、ITGAM基因表达水平(P<0.01)。(1)在下调PTGS2基因表达水平方面,破血组优于活血组(P<0.01),高剂量组优于低剂量组(P<0.01),他汀组优于活血组、破血组(P<0.01);(2)在下调PADI4基因表达水平方面,破血组优于活血组(P<0.01),高剂量组优于低剂量组(P<0.01),他汀组优于活血组、破血组(P<0.01);(3)在下调ITGAM基因表达水平方面,高活血组优于高破血组(P<0.01),低活血组与低破血组作用相当(P>0.05),高剂量组优于低剂量组(P<0.01),他汀组优于活血组、破血组(P<0.01)。结论活血中药、破血中药可通过下调主动脉PTGS2、PADI4及ITGAM基因表达水平,从而起到抗动脉粥样硬化的作用。

新型阿魏酸衍生物的合成及药理活性研究

目的:NSAIDs药物抑制COX-2的同时,也使心血管风险加大,以中药活性成分为先导化合物设计药物分子,以提高其心血管安全性。方法:以阿魏酸的核心结构为先导化合物,设计合成新型阿魏酸衍生物,并进行初步的抗炎活性和心肌毒性实验。结果:代表性化合物CMY和CMZ具有显著的抗炎活性,二甲苯致鼠耳肿胀抑制率分别为45.29%和24.11%,且其心肌毒性未观察到。结论:NSAIDs药物抑制COX-2的同时,保持了PGI2与TXA2的相对平衡,促进了内源性NO的表达,有利于提高其心血管安全性。

Celecoxib的合成

以对甲基苯乙酮、三氟乙酸乙酯等为原料合成中间体 1- (4-甲基苯基 ) - 4,4,4-三氟 - 1,3-丁二酮 ,再与对肼基苯磺酰胺盐酸盐进行脱水环合即得 celecoxib,总收率 48.3%。

链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠肾脏COX-2/PGE2/EPs的表达

【目的】探讨链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠肾脏COX-2/PGE2/EPs的表达情况。【方法】多次小剂量腹腔注射STZ诱导1型糖尿病小鼠模型,实验分为两组:正常对照组(NC)和糖尿病组(DM)。ELISA法检测血清和尿液中前列腺素E2(PGE2)的表达水平;RT-q PCR法检测肾组织环氧合酶-2(COX-2)、膜结合型前列腺素E2合成酶-1(m PGES-1)、各型EP受体(EP1、EP2、EP3、EP4)的m RNA表达水平;Westernblot法检测相应蛋白表达水平。【结果】随着周龄增加,DM组小鼠逐渐出现明显多饮、多尿、体质量下降等糖尿病消耗症状;与NC组小鼠相比,DM组小鼠空腹血糖(FBG)和24 h尿蛋白排泄量均显著增加(P<0.05);肾脏COX-2和EP4表达水平明显上调(P<0.05)、而m PGES-1、EP1、EP2、EP3 m RNA表达无显著变化(P>0.05);同时,DM组小鼠24 h尿PGE2定量显著高于NC组(P<0.05)。【结论】1型糖尿病小鼠肾脏组织中,早期即可检测到COX-2和EP4表达上调,伴24 h尿PGE2定量增加,提示COX-2/PGE2/EP4信号轴激活可能参与了糖尿病肾病的发生发展。

食管癌高表达抗原HLA-A2/A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位预测

目的预测食管癌普遍高表达蛋白COX-2和MAGE-4的HLA-A2/A3限制性CTL表位。方法运用生物信息学的方法,SYFPEITHI初步预测,结合三维构效定量关系和蛋白酶体酶切位点分析。结果对SYFPEITHI预测>20的九肽用MHCPred和NetChop3.0作进一步分析,并与已报道抗原肽进行比对,初步筛选出了42个潜在的CTL表位。结论这42个九肽均未见文献报道,进一步鉴定将为CTL表位疫苗的研究提供更多的线索。其中,MAGE-422-30、202-210、286-294及COX-2479-4874个九肽具有与HLA-A2和HLA-A3超型潜在的交叉免疫活性,将为研制简约的高效广谱食管癌疫苗提供候选肽。

JWH133对MPP^+诱导的原代星形胶质细胞COX-2和iNOS表达的影响

目的探讨大麻素Ⅱ型受体(CB2受体)激活对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导原代星形胶质细胞炎症反应的影响。方法培养原代星形胶质细胞,生长状态良好时将其分为Control组、MPP+组、JWH133(CB2受体激动剂)+MPP+组、AM630(CB2受体抑制剂)+JWH133+MPP+组。应用免疫印迹法(Western Blot)检测Control组和MPP+组细胞CB2受体蛋白的表达。应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组环氧化酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达。结果与Control组相比,MPP+组的CB2受体蛋白表达上升(F=29.78,P<0.01)。与Control组比较,MPP+组COX-2和iNOS基因的表达明显上调(F=22.59、11.27,q=10.13、5.57,P<0.01);JWH133预处理抑制MPP+诱导的COX-2和iNOS基因表达的上调(q=6.26、4.16,P<0.05);此抑制作用可被AM630所阻断(q=5.34、5.67,P<0.01)。结论激活CB2受体可抑制MPP+诱导的原代星形胶质细胞炎症反应。