固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备及其在4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇的O-糖苷化合物分析中的应用

采用溶胶-凝胶法,以丙烯酰胺作为单体,制备了基于有机-硅胶杂化整体柱的β-葡萄糖醛酸酶反应器。优化了硅酸甲酯和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅的物质的量的比、丙烯酰胺和聚乙二醇的用量,以及水浴温度等制备条件,获得了孔隙均匀、通透性良好、机械强度高的有机-硅胶杂化整体柱。采用光学显微镜和扫描电镜表征杂化整体柱。进一步将β-葡萄糖醛酸酶共价键合在整体柱上,以4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)的O-糖苷化合物(NNAL-O-Gluc)为底物研究酶反应器的水解效果,实验结果证明酶反应器在室温条件下的水解效率大大提高,实现了NNAL-O-Gluc高效水解与分析,解决了目前NNAL-O-Gluc分析中前处理水解效率低的问题。

高效液相色谱-大气压化学电离串联质谱法研究4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮体外模拟代谢作用

烟草特异亚硝胺4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）是一种存在于烟草烟气及烟草制品中的强致癌物,其致癌机理是通过细胞色素P450酶的代谢活化生成活泼亲电试剂,导致DNA损伤,因此,建立NNK体外模拟代谢产物的定量分析方法对于研究烟草致癌物具有重要意义.本实验利用高效液相色谱-大气压化学电离串联质谱法（HPLC-APCI-MS/MS）对NNK代谢产物4-羟基-1-（3吡啶基）-1-丁酮（HPB）进行定量分析.使用选择反应扫描（SRM）模式监测了HPB和内标[3,3,4,4-D4] HPB,分析方法在0.2～400 nmol/L范围内线性关系良好,线性相关系数R2=0.999 9,检出限（LOD）为0.025 nmol/L（S/N=3）,定量限（LOQ）为0.05 nmol/L（S/N=10）.方法的日内和日间准确度为96.6％～101.8％,回收率为98.1％～102.6％.所建立的NNK体外模拟代谢模型可用于烟草特异亚硝胺代谢活化分子机制的研究,为定量分析吸烟致癌相关生物标志物奠定基础.

在线液相-气相二维色谱高灵敏测定卷烟主流烟气中的4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮

建立了在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中4-（N-甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）的方法。NNK的分析在在线凝胶气质联用仪上进行,采用自行装填的微型碱性氧化铝柱,并把仪器上的凝胶柱换成氧化铝柱,用于NNK的分析。捕集有主流烟气总粒相物的剑桥滤片用二氯甲烷提取,以D4-NNK为内标,提取液经微型氧化铝柱分离,含NNK的部位切割进入气相色谱,排干溶剂后启动气相色谱升温经毛细管柱进行分离,用质谱检测。本方法将烟气国标方法 NNK测定中的氧化铝柱色谱净化和气相色谱-质谱分析在线连接起来,可不经样品前处理净化直接进样分析;每次进样可达40μL,是常规气相色谱-质谱分析最大进样量（2.0μL）的20倍,显著提高了分析灵敏度。方法线性范围达1.2~120 ng/m L,相关系数为r=0.9998,回收率为93.9%~96.0%;检出限和定量限分别为0.25 ng/m L和0.9 ng/m L,样品分析结果与中国烟草总公司企业标准方法进行对比,结果相符合。

HPLC-MS/MS法检测小鼠组织中的O^6-甲基鸟嘌呤

建立了检测小鼠组织(肝脏和肺)中O6-甲基鸟嘌呤(O6-mG)的高效液相色-谱串联质谱(HPLC-MS/MS)方法,并对正常与酒精性脂肪肝小鼠肝脏和肺中的O6-mG进行了测定。以[CD3]O6-mG为内标,组织样品用DNA试剂盒提取,提取物经80Ⅱ下酸解和HLB固相萃取柱萃取后进行HPLC-MS/MS分析。结果表明:①O6-mG在0.2~10 ng/mL内线性关系良好(r=0.9998),检出限为0.044 ng/mL,回收率和相对标准偏差(RSD)分别为88.2%~92.2%和0.96%~2.13%。②给药4 h后,酒精性脂肪肝小鼠肝脏和肺中O6-mG的含量分别为正常小鼠的1.25倍和2.96倍,说明长期大量饮酒可能会促进4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的器官致癌性。该方法适合用于分析小鼠组织中O6-mG。

HILIC-MS/MS测定家兔血液中的NNK及其7种代谢物

建立了亲水相互作用色谱-串联质谱(HILIC-MS/MS)分析家兔血液中NNK及其代谢物的方法。以NNK-d4、NNAL-d3和HPB-d4为内标,血浆样品用乙腈沉淀蛋白后,直接进行HILIC分离和多反应监测(MRM)分析。结果表明,NNK及其代谢物的检出限在0.016～0.082 ng/mL之间,r为0.9991～1.0000,加标回收率为76.9%～116.3%,日内精密度为0.53%～6.52%。该方法适合于同时分析血液中的NNK及其7种代谢物。

4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮接触生物标志物的研究进展

4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)是烟草特有亚硝胺(TSNA)中具有强烈致癌性的物质之一,NNK在人体和动物体内产生的主要代谢物是4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)和它的糖苷化合物(NNAL-N-Glucuronidec和NNAL-O-Glucuronide)。NNAL是一种研究NNK在人体内代谢过程中致毒与解毒机制有价值的接触生物标志物。该文对NNK的流行病学、毒理学、代谢途径及其接触生物标志物的研究进展进行综述。

N'-{1-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-5-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰基}-N'-叔丁基-N-取代苯甲酰肼的合成与杀虫活性

双酰肼化合物作为一类重要的昆虫生长调节剂,已广泛应用于农作物的保护中.为了发现新颖结构的高效、低毒双酰肼杀虫剂先导化合物,采用点击化学常用的1,2,3-三唑杂环将新烟碱杀虫剂的药效团2-氯-5-(氯甲基)吡啶引入到双酰肼分子骨架中,设计并合成了9种未见文献报道的含双杂环结构的双酰肼目标化合物,其结构经IR,1HNMR,ESI-MS和元素分析测试技术确证.初步的生物活性测定结果表明,部分目标化合物在200mg/L质量浓度下对小菜蛾(Spodoptera exigua)和甜菜夜蛾(Plutella xylostella)表现出中等程度的杀虫活性;但所有目标化合物在200mg/L浓度下对蚕豆蚜虫(Aphis fabae)的杀虫活性均较弱..

几种中草药及绿茶对B(a)P和NNK的抗诱变作用

目的 :探讨绿茶、茶多酚、半枝莲、白花蛇舌草及犀黄丸等的水溶性提取物对苯并芘[B(a)P]和4_甲基亚硝胺基_1_(3_吡啶基)_1_丁酮(NNK)的抗诱变作用。 方法 :采用沙门氏菌回变试验(Ames试验)。 结果 :除各受试物的最小剂量组外 ,其它浓度的绿茶、茶多酚、半枝莲、白花蛇舌草及犀黄丸等均具有明显的抑制B(a)P和NNK诱发TA98 和TA100 回复突变的作用。经统计学处理 ,各试验组与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。 结论 :受试的中草药和绿茶对B(a)P和NNK均有抗突变作用 。

三重四极杆气质联用法测定卷烟主流烟气中NNK

为了测定卷烟主流烟气中4-(甲基亚硝胺基-)1-(3-吡啶基-)1-丁酮(NNK)的含量,建立了三重四极杆气质联用仪(GC-MS/MS)测定方法。按照标准条件抽吸卷烟,捕集在剑桥滤片上的卷烟烟气粒相物用二氯甲烷萃取并以氘代NNK为内标,经固相萃取净化后,用三重四极杆气质联用仪测定卷烟烟气中NNK的含量。方法的相对标准偏差为2.3%～2.7%(n=6)、回收率为98.9%～116.8%、定量下限为0.087ng/cig,完全可以满足日常检测的要求。本方法采用商品化固相萃取柱,避免了样品浓缩、转移等操作步骤,节省试剂并且提高了工作效率。应用本方法对2R4F和其他不同类型的卷烟样品烟气中NNK进行了检测,检测数据与国家标准方法GB/T 23228-2008(GC-TEA)一致性好,验证了本方法的准确性。

NNK遗传毒性杂质及其异构体检测方法的探索性研究

亚硝胺类化合物由于其结构上存在N-N=O键,容易发生异构化现象。本研究在采用HPLC法对4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)进行分析时,观察到双色谱峰现象。并采用PFP色谱柱对NNK及其异构体进行有效分离,采用LC/MS二级质谱扫描确认了色谱图中2个色谱峰的分子、离子以及碎片离子均相同。同时采用NMR法对一级和二级核磁信号进行结构归属,进一步确证NNK中的杂质峰均属于同分异构体。此外,通过变温试验,采用NMR法测定了NNK的异构化比例范围;通过HPLC的变温试验,确证了NMR的结果。本研究通过多角度试验方法验证NNK存在互变异构体的现象,有利于NNK含量的准确分析,同时为该类异构化遗传毒性杂质的检测提供了理论依据。

环状RNA circNIPBL对肺癌细胞DNA损伤的影响

目的探讨烟草特异性致癌物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)暴露对肺癌细胞DNA损伤的影响以及环状RNA circNIPBL在NNK诱导DNA损伤效应中的调控作用。方法分别使用0(对照)、50、100、200、400μmol/L的NNK染毒人肺癌上皮(A549)细胞48 h。采用CCK-8法检测细胞活性,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测circNIPBL的表达水平;运用ELISA法检测细胞上清中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的分泌水平;使用碱性彗星实验检测细胞的DNA损伤情况;采用Western blot法检测DNA损伤相关蛋白γ-H2AX的表达水平。结果与对照组比较,200、400μmol/L NNK暴露A549细胞的存活率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。circNIPBL的表达水平随着NNK染毒剂量的升高呈现剂量依赖性表达上调;其中,与对照组比较,400μmol/L NNK暴露A549细胞的circNIPBL表达上调了7.13倍,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测发现,敲低circNIPBL表达可显著降低NNK染毒A549细胞上清中的8-OHdG水平,而过表达circNIPBL则促进NNK暴露所致的8-OHdG分泌。碱性彗星实验结果提示,敲低circNIPBL表达能够显著降低NNK暴露导致的DNA损伤程度,过表达circNIPBL则进一步加重NNK所致的细胞DNA损伤。此外,敲低circNIPBL的表达能够降低NNK染毒A549细胞中γ-H2AX的蛋白水平,而过表达circNIPBL则提高γ-H2AX的蛋白水平。结论环状RNA circNIPBL在NNK暴露的A549细胞中显著上调,且参与调控NNK诱导的A549细胞DNA损伤。