6-(4-苯磺酰基-3-甲基-2-丁烯)-基-2,3-二甲氧基-5-甲基氢醌双苄醚的合成

以异戊二烯为原料,经与苯磺酰氯加成、水解乙酰化、皂化3步反应,制得末端羟基取代的异戊二烯短侧链——(E)-1-苯磺酰基-2-甲基-4-羟基-2-丁烯(简称产物A),并用乙酸乙酯-乙醚混合溶剂对产物A进行提纯精制。以还原型辅酶Q0(氢醌)为母环,杂多酸为催化剂,与产物A进行偶联反应,然后采用溴化苄对母环羟基进行保护,用乙醚-异丙醚的混合溶剂进行提纯精制,选择性结晶得到了侧链延长法合成辅酶Q10的关键中间体辅酶Q1前体,即6-(4-苯磺酰基-3-甲基-2-丁烯)-基-2,3-二甲氧基-5-甲基氢醌双苄醚(简称产物B)。探讨了各主要影响因素对合成反应过程及结果的影响,目标产物B收率达75%(以产物A为基准)。产物A与目标产物B经测熔点、1H NMR分析和FTIR分析鉴定,确证其为(E)-异构体。

铁皮石斛1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因的克隆与表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphatereductase,HDR]基因,并分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及不同信号分子诱导下的表达模式。方法采用RT-PCR和RACE等方法获得铁皮石斛HDR基因(Do HDR)全长,利用DNAMAN和MEGA6.0对其他物种的HDR基因编码的氨基酸序列进行同源性分析和进化关系分析,使用实时荧光定量分析HDR基因的表达模式。结果成功获得Do HDR基因,Gen Bank登录号为KC344827,全长1 658 bp,编码460个氨基酸,与其他科属植物的同源性达到80%以上。Do HDR基因在铁皮石斛叶片中表达量最高,从高到低依次是根、茎、原球茎;且受到脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)信号分子的诱导。结论从铁皮石斛中获得Do HDR基因,为进一步阐明铁皮石斛萜类化合物合成途径中该基因的重要作用奠定了理论基础。

银杏1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因(hdr)转化银杏的研究

采用根癌农杆菌介导法,将来源于银杏(Ginkgo bilobaL.)的1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR)基因(Gbhdr)转化银杏种子胚.通过潮霉素(10 mg/L)筛选,获得了8个抗性愈伤组织系,PCR检测表明其中有7个为转基因愈伤组织系.采用HPLC-ELSD法对其中4个独立转化系中的银杏总内酯含量进行了测定,结果显示转化系h-8中银杏总内酯含量相比非转基因系大幅提高,达到非转基因系的2.5倍.RT-PCR结果显示该4个转化系中Gbhdr的表达量相比非转基因对照都有不同程度地提高.

蓝桉叶片桉叶素生物合成机理研究

为探明蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)叶片桉叶素合成过程中关键酶活性与桉叶素含量的关系,以不同发育阶段的蓝桉叶片为研究对象,测定桉叶素相对含量和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI)、香叶基焦磷酸合酶(GPPS)、桉叶素合酶(CinS)活性,并对其进行方差分析、相关性分析、通径分析.结果表明,随着蓝桉叶片成熟度增加,桉叶素相对含量逐渐增加,HMGR、DXS、GPPS、IPPI的酶活性逐渐下降.在一个完整的年生长周期内,桉叶素相对含量在7月份显著高于其余月份,HMGR、DXS、GPPS、CinS活性在5、6月份显著高于其余月份.桉叶素相对含量与DXS、CinS活性显著正相关,与HMGR、IPPI、GPPS酶活性极显著负相关.研究结果表明,在5、6月份增强蓝桉幼嫩叶片的DXS和CinS活性,可以有效提高桉叶素积累,进而提高蓝桉桉叶油的产量和品质.

龙骨马尾杉PcHDR1基因克隆及序列分析

该研究采用RT-PCR方法对龙骨马尾杉Phlegmarirus carinatus(Desv.)Ching 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]基因Pc HDR1的编码区进行克隆并利用生物信息学方法进行序列分析。根据实验室已获得的龙骨马尾杉转录组数据,从中获得1条编码HDR的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的全长c DNA序列,所克隆的Pc HDR1基因编码区长为1 437 bp,编码478个氨基酸残基,Gen Bank登录号为JQ957845。Pc HDR1与银杏Ginkgo biloba的HDR序列同源性最高,达78%。生物信息学预测Pc HDR1蛋白没有跨膜区,具有Lyt B保守结构域,不含信号肽。该研究克隆并获得了龙骨马尾杉Pc HDR1基因的编码区序列,并对其编码的蛋白进行了序列分析及结构域预测,为进一步研究HDR的功能奠定基础。

铁皮石斛HDS基因的克隆与初步表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase,HDS)基因,在大肠杆菌中诱导融合蛋白,并探究该基因在铁皮石斛不同组织中的表达规律。方法采用RT-PCR和RACE等方法获取铁皮石斛HDS(Do HDS)的c DNA全长,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,使用Real-Time PCR分析Do HDS在不同组织的表达特征,构建原核表达载体p ET-28a(+)-Do HDS,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果成功获得Do HDS的c DNA全长序列,Gen Bank登录号为KJ161312,全长2 666 bp,ORF为2 238 bp,编码745个氨基酸。Do HDS在各组织中均有表达,在茎中表达量最高,为原球茎的5倍;SDS-PAGE结果显示诱导产物为1个相对分子质量(82 700)与理论值相符的融合蛋白。结论克隆了Do HDS的c DNA全长序列,探究其在不同组织中的表达模式,建立了原核表达体系,为后续研究Do HDS的功能提供了一定的理论基础。

卷叶贝母HDS基因的克隆与表达分析

为克隆卷叶贝母中编码生物碱合成相关的关键酶4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸合酶(4-hydroxy-3-methyl-2-butenyl pyrophosphate synthase,HDS)的开放阅读框,运用生物信息学和荧光定量手段对该基因进行分析。基于转录组测序结果,本研究首先通过PCR技术克隆获得卷叶贝母HDS基因(FcHDS)开放阅读框序列,并运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,其次利用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Fc HDS基因在野生鳞茎和再生鳞茎(通过激素组合刺激获得的组织培养物)中的表达情况。经研究发现FcHDS ORF片段长度为2223 bp,编码740个氨基酸,并与NCBI上公布的油棕、凤梨、烟草、水稻等植物HDS蛋白具有较高的同源性;二级、三级结构预测发现FcHDS蛋白主要由α-螺旋构成;RT-qPCR与总生物碱含量测定实验表明FcHDS基因的表达水平与先前研究的总生物碱含量的变化趋势一致,均为再生鳞茎高于野生鳞茎,而且在根茎叶中都有表达,说明不具有组织特异性。FcHDS蛋白质特征区及同源性等生物信息学分析结合激素组合响应模式的分析结果证明FcHDS可能是一个有生物学功能的蛋白质,其表达受激素组合诱导表达,本研究为卷叶贝母HDS基因功能研究打下基础,同时为利用基因工程手段提高卷叶贝母中生物碱含量提供了理论基础。