β-葡聚糖苷酶对三七皂苷-Fe的转化研究(英文)

目的本文首次报道利用工业酶制剂对三七皂苷-Fe进行酶转化的研究。方法从三七茎叶总皂苷中分离鉴定三七皂苷-Fe,利用工业酶制剂β-葡聚糖苷酶对三七皂苷-Fe进行转化。树脂法、硅胶柱层析及薄层层析法分离、纯化酶转化产物;1HNMR和13C NMR光谱数据分析鉴定酶转化产物Ⅰ是20(S)原人参二醇-20-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→6)β-D-吡喃葡萄糖苷(人参皂苷-Mc);转化物Ⅱ是20(S)原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(C-K)。结果酶解动力学的研究中,经过24h的反应,三七皂苷-Fe的转化率接近95%。结论β-葡聚糖苷酶转化三七皂苷-Fe的途径为三七皂苷-Fe→人参皂苷-Mc→C-K。

pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型

pH值是影响酶催化反应速率的重要因素之一,建立动力学模型有助于定量分析酶解反应。经典的“三状态”动力学模型未考虑pH值对底物解离状态的影响及产物抑制的作用,该文对“三状态”动力学模型进行改进。在一系列假设基础上提出绿色木霉产纤维素酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的反应机理,建立了pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的动力学模型,推导出反应速率表达式。Lineweaver-Burk作图法求得内切β-葡聚糖苷酶水解CMC-Na在不同pH的动力学参数:K′m和V′max,试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合,从而模型得以验证。

利用瞬间表达技术分析小麦几丁质酶和β-1,3葡聚糖苷酶基因的抗病性功能

几丁质酶基因和-β1,3葡聚糖苷酶基因是植物抗病反应过程中的两类重要的病程相关蛋白(PR)基因。为了快速准确地评价此类基因组成性表达后的抗病效果及在分子育种上的应用价值,利用瞬间表达技术分别在感病小麦品种离体叶片表皮细胞中过量表达1个小麦几丁质酶基因Cht4和2个小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2和G lb3s6,并以GUS基因的共表达标识阳性转化细胞。基因枪轰击后高密度接种白粉病菌孢子,40h后观察转化阳性表皮细胞及其表面孢子的发育,并以阳性转化细胞中白粉病菌成功侵入的细胞所占比例(侵入频率)为指标分析目标基因的表达对白粉病菌入侵及吸器形成产生的影响(对照为单独导入GUS基因的表皮细胞)。结果表明,小麦几丁质酶基因Cht4(侵入频率为18.3%,对照为25.04%)和小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2(侵入频率为19.63%,对照为24.63%)在感病小麦品种叶片表皮细胞中的瞬间表达,对白粉病菌侵入和吸器形成均有抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性。

重组β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中的共表达

β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖苷酶是纤维素酶的重要组分，多基因的共表达在各领域有重大的应用价值，本研究利用pET32a和pET30b两个载体的不同抗性的特性，在大肠杆菌中将β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因，实现了不相容性共表达，获得了产两种酶的工程菌，酶活力可达1196．8U／mL。比单一酶组分的酶活力高，酶学性质分析显示共表达酶的最适反应pH为6．0，最适反应温度60℃，在pH5-7范围内能保持较高活性，酶活可达最高酶活的80％以上，在30～60％范围能有较高的温度稳定性，酶活维持在80％以上。这一结果将为工业应用的进一步研究提供理论基础。

一株绿色木霉产外切β-葡聚糖苷酶条件及其纯化与性质的研究

从树林中腐烂木块上采集并筛选出一株分泌外切β葡聚糖苷酶(exo1,4βD glucanaseorcellobiohydrolase,CBH)的绿色木霉菌株.在100mL的锥形瓶中装入40mL培养基的产酶状况最好,其通气量最佳,培养液初始pH为8时绿色木霉产生的CBH活力最高.随绿色木霉生长时间的延长,CBH的活力与培养基中的葡萄糖含量呈交替的一高一低的波浪状变化.通过硫酸铵分部分离、葡聚糖G100凝胶过滤、DEAE纤维素52阴离子交换柱层析等方法使绿色木霉所产的CBH达到了电泳纯,纯化倍数为16.3.CBH的反应最适温度为60℃,最适pH为6.0,Km(底物为羧甲基纤维素钠)为17.34mg/mL.

绿色木霉MJ1产内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用KTAUPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后酶的比活力提高了28·6倍,回收率为19·7%。SDS-PAGE后经BIO-RAD凝胶成像系统分析该内切酶的分子量为64·7kD。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度53℃,最适pH为4·2,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为1·230×10-2g/mL、2·396×10-2mg/(mL·min)。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为2·2mmol/L时分离效果达到最佳。

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。

康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

康氏木霉GIMP3.444经摇瓶发酵,获得分泌到胞外的纤维素酶,粗酶液经(NH4)2SO4分级沉淀、Sephacryl S200凝胶过滤层析、DEAE Sepharose FF离子交换层析及Octrl Separose CL-4B疏水层析分离纯化出一种内切型的β-葡聚糖苷酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,BIO-RAD分析相对分子量为61.8 ku。该内切β-葡聚糖苷酶的最适反应温度为55℃,最适反应p H值为4.4,作用于羧甲基纤维素钠时,Lineweaver-Burk法求得Km、Vmax分别为4.81 mg/m L、2.48 mg/(min·m L)。

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了绿色木霉WS-71纤维素酶系中的内切型β-1,4-葡聚糖苷酶组分。通过SDS-PAGE电泳测得分子量为41.8kD,该酶组分的最佳水解温度是50℃,最适pH为4.6。酶在温度40～70℃和在pH4.0￣5.0的区间稳定。Fe3+,K+,Ca2+,Mg2+,Mn2+对酶解有促进作用,Hg2+,Cu2+,Zn2+和EDTA对酶解有不同程度的抑制作用。作用于羧甲基纤维素钠的Km值为16.78mmol/L,Vmax为5.612×10-4mol/min,Kcat为6.97S-1。

1株产纤维素酶细菌的内切-β-葡聚糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

为对1种细菌来源的内切-β-葡聚糖苷酶进行分离纯化和酶学性质研究,利用盐析沉淀、凝胶层析、疏水层析和弱阳离子交换色谱等对细菌菌株DM-4所产内切-β-葡聚糖苷酶进行了分离纯化,利用SDS-PAGE电泳对其纯度和分子量进行检测,考察温度和pH值对酶活力的影响,最后计算酶的反应动力学常数。结果显示,经分离纯化,获得2个酶活组分CMC酶Ⅰ和酶Ⅱ,其纯化倍数分别为45.94倍和32.27倍,回收率分别为14.66%和8.33%。CMC酶Ⅰ和酶Ⅱ分子量分别为38.99、45.53 ku,其最适作用温度分别为55~60℃和55℃,最适pH值均为7.5。温度低于70℃时,2种酶组分均对热稳定,并在pH值为6.0~8.0范围内具有良好稳定性。CMC酶Ⅰ的K_(m)为2.55 g/L,V_(m)为37.59μg/(min·mL);CMC酶Ⅱ的K_(m)值为4.37 g/L,V_(m)为28.82μg/(min·mL)。结果表明,采用盐析沉淀、凝胶层析、疏水层析和弱阳离子交换色谱多种分离技术对菌株DM-4所产内切-β-葡聚糖苷酶具有良好的分离纯化效果,经凝胶电泳检测,酶组分达电泳级纯度。酶学性质表明,菌株DM-4所产的2种CMC酶组分均为中性偏碱性纤维素酶,这与霉菌来源的纤维素酶有所不同。

一种康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为获得康氏木霉(Trichodermakoningii)内切β-葡聚糖苷酶组分,并研究其酶学性质,通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析对康氏木霉GIMP3.444纤维素酶主要组分进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测蛋白质纯度和分子量,MALDI-TOFMS鉴定蛋白质种类。结果显示,从康氏木霉所产的纤维素酶系中分离纯化获得一种内切β-葡聚糖苷酶组分,相对分子质量为44 600,酶的比活力为19.65 U/mg。该内切酶的最适反应p H值为4.5,最适反应温度为55℃。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物时,酶的米氏常数(Km)为7.22 mg/ml。不同金属离子对酶活性影响不同,其中Ca2+(0.3 mmol/L)对酶的抑制作用较强,抑制了近35%的活力。通过MALDI-TOFMS鉴定及数据库分析,确定该酶为一种新的内切β-葡聚糖苷酶组分。

β-1,4-葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中分泌表达

采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81 bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657 bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36e-usp45-egl3及重组大肠杆菌E.coli DH5α/pMG36e-usp45-egl3。分析重组大肠杆菌的表达效果及表达产物降解纤维素的能力。结果表明,重组大肠杆菌DH5α/pMG36e-usp45-egl3经14 h培养能分泌酶活为226 mU/mL的β-1,4-葡聚糖内切酶,并有效地降解了羧甲基纤维素钠。其中分泌的β-1,4-葡聚糖内切酶降解羧甲基纤维素钠生成还原糖的速率为2.35 mg/(h·mL)。

基于数据挖掘模型分析1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP联合检测对艾滋病合并肺孢子菌肺炎的诊断价值

目的:探讨1-3-β-D葡聚糖、乳酸脱氢酶(LDH)、CD4^(+)T淋巴细胞、C反应蛋白(CRP)联合检测对艾滋病(AIDS)合并肺孢子菌肺炎(PCP)的诊断价值。方法:选取2016年4月至2022年2月于温州市第六人民医院收治的315例艾滋病患者为研究对象,其中170例合并PCP患者为研究组(AIDS/PCP组),145例肺部无感染患者为对照组(AIDS组)。检测两组患者1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP水平,构建多层感知器(MLP)神经网络模型、卡方自动交互检测(CHAID)决策树模型、Logistic回归模型,通过受试者工作特征(ROC)曲线评估1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP联合检测对AIDS合并PCP的诊断效能。结果:AIDS/PCP组的1-3-β-D葡聚糖、LDH、CRP水平显著高于AIDS组,CD4^(+)T淋巴细胞计数显著低于AIDS组,差异均有统计学意义(P<0.001);构建的MLP神经网络模型1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP联合检测诊断AIDS合并PCP的特异度、敏感度、准确率分别为88.97%、86.47%、87.62%,ROC曲线下面积(AUC)为0.942;CHAID决策树模型特异度、敏感度、准确率分别为70.34%、84.12%、77.78%,AUC为0.871;Logistic回归模型特异度、敏感度、准确率分别为89.66%、84.71%、86.98%,AUC为0.939。结论:MLP神经网络模型联合1-3-β-D葡聚糖、LDH、CD4^(+)T淋巴细胞、CRP检测对AIDS合并PCP具有良好的辅助诊断价值。

培养基组分对纤维杆菌X4-9发酵产纤维素酶的影响

考察发酵培养基组分对纤维杆菌X4-9发酵产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的影响。应用DPS软件的二次回归旋转中心组合实验设计方法,对纤维杆菌X4-9的发酵培养基(花生秸秆粉、蔗糖、尿素、(NH4)2SO4、硫酸镁、磷酸二氢钾)进行了优化。结果表明:在试验数值范围内,花生秸秆粉、蔗糖和(NH4)2SO4对酶活均会产生极显著的正效应,而尿素、硫酸镁和磷酸二氢钾的用量则具有明显的负效应;在优化的发酵培养基配方(花生秸秆粉30g/L、蔗糖20g/L、尿素2.5g/L、(NH4)2SO410g/L)下,葡萄糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分别达到2.705163,5.723014,3.614921IU/mL,比初始发酵培养基配方下的各酶活分别提高了123.66%,146.32%和186.40%。纤维杆菌X4-9均能同时产生葡萄糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶等纤维素降解复合酶系,且这些酶高产的培养基条件较为一致。

三七茎叶总皂苷酶转化产物和C-K的抗肿瘤作用

目的:研究三七茎叶总皂苷酶转化产物和人参皂苷化合物K(C-K)的抗肿瘤作用。方法:利用β-葡聚糖苷酶转化三七茎叶总皂苷,转化产物经大孔吸附树脂富集和纯化,硅胶柱层析及制备薄层层析分离纯化后得到C-K。观察酶转化产物和C-K对S180肿瘤细胞生长的抑制作用及对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响。结果:三七茎叶总皂苷酶转化产物和C-K的抑瘤率分别为41.8%和44.7%;对艾氏腹水癌小鼠延长存活期分别为3.9d和4.6d。结论:三七茎叶总皂苷酶转化产物和C-K具有较强的抗肿瘤作用。

干血滤纸片和白细胞酸性α-葡萄糖苷酶活性测定平台的建立及临床应用

目的建立干血滤纸片和白细胞酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）活性测定方法及正常参考值，用于糖原累积病Ⅱ型（GSDⅡ患者的酶学诊断。方法利用GAA特异性水解荧光底物4-MUG的原理，采用阿卡波糖抑制其同工酶，建立干血滤纸片（DBS）和白细胞测定GAA活性方法。取700例DBS样本和100例白细胞样本作为正常对照建立DBS和白细胞测定GAA活性正常参考值，并对临床疑诊4例患者及其父母进行GAA活性测定。结果DBS法具有良好的精密度，室温或低于室温保存至少4周对DBSGAA活性无明显影响。正常新生儿和儿童-成人DBS的GAA参考范围分别为8．92～60．03pmol／（punch·h）和8．00～37．43pmol／（punch·h）；正常人白细胞GAA参考范围：12．56～50．26nmol／（mg蛋白·h），共检出4例GSDⅡ型患者。结论DBS法测定GAA活性具有敏感、快速、高通量等特点，适于GSDⅡ型高危人群筛查和诊断；白细胞法测定GAA活性也具有快速、特异性高等特点，适于患者的确诊。

茉莉酸甲酯对烟草幼苗抗病毒相关酶活性的影响

研究茉莉酸甲酯对烟草幼苗抗病毒相关酶活性的影响.以茉莉酸甲酯(methyljas monate,MJ)处理或接种烟草花叶病毒的广黄55和K326烟草幼苗为材料,测定一些抗病毒相关酶活性.发现MJ处理提高广黄55幼苗的几丁内切酶、几丁外切酶、超氧物歧化酶(SOD)和脂氧酶活性,降低β1,3-葡聚糖苷酶活性;MJ处理后接种烟草花叶病毒,K326幼苗的β1,3-葡聚糖苷酶和SOD活性都降低.上述结果表明,MJ诱导K326抗花叶病毒的机制可能不同于巴西烟草.

里氏木霉产纤维素酶的诱导和合成机理研究进展

纤维素酶是一类诱导酶,诱导剂对纤维素酶的表达是必需的。常用的诱导剂如纤维素、槐糖、乳糖、纤维二糖、山梨糖等。里氏木霉主要表达3种纤维素酶:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶,其中以外切葡聚糖苷酶Ⅰ的合成量最多,其次是内切葡聚糖苷酶和β-1,4-葡萄糖苷酶。纤维素酶的合成和表达是激活原件和抑制因子共同作用的结果:诱导物质和激活元件结合激活细胞内纤维素酶的合成和表达;当纤维素酶的分解产物达到一定水平时,细胞内的抑制因子和启动子结合,阻止纤维素酶的表达。

木薯酒精废水高温厌氧消化系统中酶的提取与分布的研究

木薯酒精废水中固形物(干基)的主要成分为纤维素和半纤维素,分别为30%和18%。由于内切-β-1,4-葡聚糖苷酶(CMC酶)和木聚糖酶在高温厌氧消化过程中对纤维素和半纤维素的水解起关键作用,作者比较了从厌氧污泥中提取CMC酶和木聚糖酶的6种方法,并分析了其在厌氧污泥中的分布情况。结果表明,用质量分数1% Triton X-100来提取CMC酶和木聚糖素酶是一种高效且温和的酶提取方法,且至少有占总酶质量90%的CMC酶和70%的木聚糖酶分布在污泥絮凝体(细胞表面或胞外聚合物)中。

一株木霉菌(Trichoderma sp.)TY2纤维素酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

【目的】筛选高活力纤维素酶产生菌,高效利用纤维素资源。【方法】从朽木和和纸浆样品中分离筛选出一株产纤维素酶活较高的菌株TY2。对其形态和18SrDNA特征序列分析鉴定为木霉菌(Trichodermasp.)。对菌株发酵条件及酶学特性进行研究。【结果】TY2菌株的最佳产酶条件为:1%滤纸+2%麸皮+0.5%葡萄糖为碳源,0.5%蛋白胨为氮源,起始pH5.0,温度28℃,200r/min,5d,其CMCase和FPase活力分别达412.5和100.3U/mL。经分离纯化出TY2菌株内切β-葡聚糖苷酶。内切β-葡聚糖苷酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.6,在50℃以下,pH3.0～5.0,酶活性稳定,且在80℃仍具有降解CMC-Na的效果。同时研究发现铜离子、锌离子、钾离子和钠离子对内切β-葡聚糖苷酶的酶活有促进作用,而汞离子有明显的抑制作用。【结论】所筛选的TY2菌株具有潜在的工业应用价值。