枇杷4-香豆酸CoA连接酶的某些特性

以枇杷品种‘解放钟’果实为试材,用硫酸铵分级盐析方法提取4-香豆酸CoA连接酶,其最适温度为10和40℃,40和10℃下的热稳定性较好;最适pH为8.0且较稳定;最适底物为咖啡酸。

尾叶桉GLU4中4-香豆酰辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)是木质素合成中的关键酶,根据植物中4CL保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其4CL基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA长5 534 bp,cDNA长1 640 bp,CDS区编码544个氨基酸。Eu4CL核酸序列与GenBank已登录的桉属植物4CL基因同源性达到98%,与毛竹等其他科属植物4CL的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL结构域及AMP结合位点、CoA结合位点,与土肉桂等植物中4CL基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL基因。对Eu4CL编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对Eu4CL进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到Eu4CL基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。

拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的克隆与生物信息学分析

以拟南芥总RNA为模板,利用RT-PCR的方法从拟南芥中扩增获得一条4-香豆酰-CoA连接酶基因完整的cDNA序列,命名为4CL1。利用生物信息学生物软件对其核酸和蛋白质序列进行分析,结果表明,该序列长1 686bp,与已报道的拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的序列相似性达到98%~100%,氨基酸序列相似性为99%~100%;4CL1基因编码561个氨基酸,该氨基酸序列具有典型的4-香豆酰-CoA连接酶AMP-binding保守结构域LPYSSGTTGLPK,同时含有该蛋白家族的催化活性中心GEICIRG序列;预测的分子量为61.05kDa,理论等电点为5.25,不稳定参数为35.93,在分类上属于稳定性蛋白;二级结构主要以无规则蜷曲、α-螺旋、延伸链及β转角为主,其含量分别为34.22%、30.30%、24.06%和11.41%。

水稻4-香豆酸CoA连接酶的基本性质

用硫酸铵盐析,DEAE-纤维素柱层析的方法从水稻黄化幼苗中分离和初步纯化了4-香豆酸CoA连接酶同工酶。发现它们有着明显的底物特异性,其中同工酶Ⅰ对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸芥子酸均具有亲和性;而同工酶Ⅱ则只能对香豆酸、咖啡酸发生作用。4CL同工酶Ⅰ的最适pH在8.0左右,最适反应温度为40℃。

紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶基因的克隆和结构分析

该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法从紫穗槐 (Amorphafruticosa)茎中克隆了木质素生物合成过程中重要的酶 4 香豆酸 :CoA连接酶 (4CL)的cDNA全长序列 ,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程 .所获得的全长 4CLAcDNA ,有 1911个碱基 ,包含一个完整的阅读框架 ,编码 5 4 0个氨基酸 .氨基酸序列同源性分析表明 4CLA是典型的 4CL蛋白 ,含有预计的AMP binding位点 ,接触反应区和保守的Cys.

甘薯4-香豆酸辅酶A连接酶基因的生物信息学鉴定和表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)在苯丙烷类代谢途径中具有重要调控作用。该研究利用转录组数据在甘薯品种QS48中鉴定了11个4CL基因,并将这些基因命名为Ib4CL1~Ib4CL11。序列比对和功能域分析发现,11个Ib4CL蛋白均具有典型的4CL结构特征,包含保守的BoxⅠ和BoxⅡ的结构域。进化和保守基序分析显示,Ib4CL1和Ib4CL2属于Ⅰ类4CL,Ib4CL3属于Ⅱ类4CL,而Ib4CL4~Ib4CL11属于4CL类似蛋白。转录组数据和荧光定量PCR分析显示,Ib4CL3和Ib4CL10在甘薯QS48的叶中转录表达水平显著高于茎和块根,与绿原酸的积累呈正相关关系;Ib4CL4和Ib4CL8在嫩叶中表达较高,与花青素的积累密切相关。研究结果为进一步揭示甘薯4CL基因在苯丙烷类代谢途径中的功能奠定了基础。

丝瓜果实发育过程中4-香豆酰辅酶A连接酶在管状分子分化中的作用

对丝瓜果实发育过程中４－香豆酰辅酶Ａ连接酶作为初步纯化，并对它的一些理化性质作了研究．结果表明４－ＣＬ含有两个同工酶，酶Ⅰ纯化１５．６８倍含量为２２．６３％；酶Ⅱ纯化４４．２３倍含量为３．９１％．酶Ⅰ对香豆酸和咖啡酸的亲合性大于酶Ⅱ的，酶Ⅰ的最适温度为４０℃，最适ｐＨ为８．０．研究表明４－ＣＬ活性与木质素的生物合成和管状分子分化密切相关，它们之间存在一种顺序关系。

中草药中4-香豆酸辅酶A连接酶的遗传进化分析

目的:研究中草药中4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因的遗传进化,为中草药中有效成分黄酮类物质等的有效积累和调控奠定理论基础。方法:运用ClustalW 1.83、Mega 5.0、CodonW、DNAMAN等软件对搜集的部分中草药中的4CL进行遗传进化树的构建、密码子偏好性分析及氨基酸保守区的分析。结果:不同植物以基因家族形式出现,通过遗传密码子使用情况分析,可推测植物中表达较强的基因。遗传进化分析表明,与模式植物相比,中草药中4CL基因有的聚在一起可能具有相同的功能,推测并没有发生基因的分化,而有些基因可能具有功能的分化。结论:通过4CL基因的遗传进化树、密码子偏好性分析、酶的保守区分析,可为进一步研究4CL在中草药中的应用提供理论支持。

毛白杨4-CL cDNA的克隆、表达及活性分析

从毛白杨(Populus tomentosa)木质化茎中提取总RNA,利用RT-PCR技术进行cDNA扩增,获得1条1 621 bp的片段。测序结果表明:该片段编码536个氨基酸组成的多肽,序列中包含所有已知4-CL蛋白的2个特征序列boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。将cDNA克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,4-CL基因在大肠杆菌BL21中获得表达,所表达融合蛋白的分子量约为70 ku。酶活性分析表明:该重组蛋白对底物PA、FA、CA均表现出催化活性,其偏爱性顺序为PA>FA>CA,对SA则没有活性。

胡萝卜4CL基因家族的鉴定及分析

旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜4CL基因,揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式及胁迫响应情况,为胡萝卜4CL的功能研究和利用奠定基础。基于AMP结合结构域(PF00501)的隐马尔可夫模型文件,利用HMMER软件对胡萝卜蛋白质数据库进行检索,获得胡萝卜4CL基因(命名为Dc4CL);利用ProtParam分析Dc4CL的理化性质;利用MEGA6对Dc4CL进行系统进化分析;使用GSDS2.0、MEME分析Dc4CL的基因及蛋白结构;利用荧光定量PCR技术对Dc4CL的组织表达模式及胁迫响应情况进行研究。结果表明,胡萝卜基因组中存在12个4CL基因,分别为Dc4CL1~Dc4CL12。Dc4CL基因开放阅读框(ORF)长度为1350~3363 bp,编码蛋白质长度为449~1120 aa,编码蛋白的分子质量和等电点分别为48.92~123.73 ku和5.34~8.82。系统进化分析表明,Dc4CL与其他来自水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4CL蛋白可分为两个类群。结构分析表明,Dc4CL基因外显子数目为4~11个,其蛋白序列中均含有BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG)两个保守序列。荧光定量PCR结果表明,Dc4CL3、Dc4CL12在胡萝卜叶片及肉质根中均有表达,而Dc4CL8主要在叶片中表达,盐胁迫和低温胁迫均使Dc4CL3、Dc4CL8、Dc4CL12的表达降低。总之,胡萝卜的12个Dc4CL基因在影响4CL蛋白功能的关键位点处具有保守性,而在其他位置上存在一定的差异,且部分成员在逆境胁迫应答过程中可能发挥了一定的作用。

五节芒CCoAOMT和4CL的克隆和表达分析

木质素是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育和抵御病原微生物的侵害方面发挥着重要的作用,但木质素结构稳定,成为生物质能源转化的障碍。以五节芒(Miscanthus floridulus)为材料克隆得到了木质素合成过程中的关键酶CCoAOMT基因全长CDS序列和4CL基因的CDS半长序列,并对其CDS和氨基酸序列与其他物种进行了比对分析。相应的qRT-PCR分析显示,2个基因在五节芒的幼苗期、抽穗期的茎节、成熟叶片、幼穗都有表达,且与木质素的合成有一定的相关性。间苯三酚溶液染色结果亦显示,2个基因的表达规律与茎秆的木质化进程一致。五节芒CCoAOMT和4CL基因的克隆和表达分析将为进一步研究其生物学功能和改良能源作物奠定基础。

4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)和聚酮合酶(PKS1)的融合蛋白在莱茵衣藻中表达促进树莓酮积累

树莓酮具有重要的医药价值,如抗流感、预防糖尿病等。为了在莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii中获得树莓酮,本研究将树莓酮合成的最后两个步骤中的酶,即4-香豆酰-Co A连接酶(4-coumaryl-Co A ligase,4CL)和聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS1)通过甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(Gly-Ser-Gly,GSG)三肽接头融合在一起,构建莱茵衣藻表达载体p Chla-4CL-PKS1。通过电转化的方法将由PSAD启动子驱动的融合基因4CL-PKS1插入野生型莱茵衣藻(CC125)和细胞壁缺失型莱茵衣藻(CC425)中。结果在表达4CL-PKS1融合蛋白的野生型莱茵衣藻和细胞壁缺失型莱茵衣藻中,树莓酮含量分别为6.7μg/g (鲜重)和5.9μg/g (鲜重),高于天然植物中树莓酮的含量(2–4μg/g)。

RNAi沉默Fa4CL基因对草莓果实花色苷代谢的影响

【目的】探讨Fa4CL与花色苷代谢之间的关系,构建RNA干扰载体转染草莓果实,研究Fa4CL基因在草莓花色苷代谢中的功能。【方法】用RT-PCR方法从‘阿尔比’草莓(Fragaria×ananassa‘Albion’)果实中克隆Fa4CL基因。构建不含内含子的发夹结构干扰载体p BI-4CLi,将其转入农杆菌GV3101,采用无菌注射器注入到授粉后14 d的‘阿尔比’草莓果实中转染,与对照果比较表型变化、物质变化,半定量RT-PCR检测Fa4CL基因的表达量的变化。【结果】克隆的Fa4CL的CDS,长1638 bp,编码545个氨基酸。与森林草莓Fv4CL2基因序列的同源性较高,为98.4%。p BI-4CLi转染果与对照果相比,转染果的果皮红色变浅。进一步利用RT-PCR分析发现,p BI-4CLi转染果Fa4CL基因表达量明显低于对照果。分析果实花色苷含量发现,p BI-4CLi转染果的花青素糖苷和花葵素糖苷分别比对照果降低了93.5%和97.0%,差异均达到显著水平。【结论】RNA干扰载体转染草莓果实的结果证明Fa4CL成功沉默,Fa4CL基因与花色苷的合成关系密切。

不同地区短葶飞蓬总黄酮含量与PAL和4CL酶活性的比较

为了探讨短葶飞蓬总黄酮含量地区差异形成的原因,从酶的角度揭示药用植物有效成分不同的原因;采集云南省不同地区短葶飞蓬野生植株,活体采回实验室4℃条件保存,鲜叶测定酶活性,剩余部分烘干研磨测定化学有效成分,比较它们总黄酮含量和苯丙氨酸解氨酶(PAL)及4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)的活性。短葶飞蓬总黄酮含量和相关酶活性都存在空间差异,其中总黄酮含量最低地区仅为最高地区的20.47%;总黄酮含量和PAL及4CL活性都为昆明待补地区最低,并且它们之间有正相关关系,说明产地间短葶飞蓬植株总黄酮含量的差异与合成过程的不同有关,但是合成的不同不能解释全部差异,总黄酮含量的不同还可能有其他原因。

苯丙氨酸代谢途径关键酶:PAL、C4H、4CL研究新进展

主要阐述了苯丙氨酸代谢途径中三种关键酶:苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)的研究进展,希望能为研究植物次生代谢途径的研究工作者提供一些帮助。

小麦Ta4CL1基因的克隆及其在促进转基因拟南芥生长和木质素沉积中的功能

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL;EC 6.2.1.12)位于苯丙烷途径分支点的上游,是苯丙烷代谢途径的核心酶,可产生木质素、黄酮类等化合物,这些化合物对植物的生长发育及环境适应性均具有重要作用。在双子叶植物中,有关4CL的研究较多,而在单子叶植物尤其是作物中的研究相对较少。本研究利用RACE技术从普通小麦中克隆了一个4CL基因Ta4CL1。系统发育分析表明,Ta4CL1与水稻、玉米和高粱等植物中在木质素合成中具有重要作用的4CLs聚成一类;利用Ta4CL1过表达、拟南芥4CLs突变体at4cl1、at4cl3和at4cl14cl3及其功能回复株系进行的分析表明,Ta4CL1与At4CL1功能相似,在植物木质素合成中具有重要作用,但未参与黄酮类化合物生物合成的调控过程;Ta4CL1是转基因拟南芥中4CL酶活性的主要贡献者。过表达Ta4CL1的转基因拟南芥叶片增大、茎更粗;Ta4CL1的表达还受茉莉酸甲酯(Methyl jasmonic acid,MeJA)、赤霉素(Gibberellin,GA)和生长素(Indoleacetic acid,IAA)等激素处理的影响。本研究为利用基因工程将Ta4CL1应用于改善小麦秸秆的利用效率提供了理论依据。

植物脂酰-CoA合成酶基因家族研究进展

脂酰-CoA合成酶在植物的脂肪酸代谢中有非常重要的作用．本文对长链脂酰-CoA合成酶（LACS）与一种新的脂酰-CoA合成酶（ACOS）的基因功能、酶学特性和基因家族表达调控的研究进展进行了综述．

对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。

4CL基因在海巴戟叶片莨菪亭累积过程中的功能研究

为明确海巴戟叶片中莨菪亭累积规律,探究4CL基因在其累积过程中起到的作用。利用高效液相色谱仪对离体的海巴戟成熟叶0~48 h内莨菪亭含量进行测定,并测定经不同浓度的阿魏酸处理后莨菪亭含量的变化。以阿魏酸为底物,利用紫外分光光度计进行酶活反应的4CL总酶活性测定。对RNA-seq结果中7个4CL基因进行qPCR,筛选出一个表达趋势与莨菪亭含量及酶活变化趋势一致的4CL基因作为关键候选基因,进行全长克隆以及生物信息学分析,最后用qRT-PCR研究其表达特性。海巴戟叶片在采摘后48 h内,莨菪亭含量在12 h时最高,达0.35 mg/g,48 h最低,为0.18mg/g。4CL总酶活性变化与莨菪亭含量趋势相近。阿魏酸处理后的叶片中4CL总酶活增加。通过qRT-PCR筛选到4CL(DN15707)基因,克隆、测序后发现其长度为1632 bp,具备完整开放阅读框,在NCBI进行序列比对及系统进化树分析,确定该基因为4CL基因家族中的4CL2基因,命名为Mc4CL2。Mc4CL2基因可能是莨菪亭累积过程中的关键基因,它能启动4CL酶活,充分利用阿魏酸底物进而导致莨菪亭累积。

植物4CL基因家族结构功能与表达特性研究进展

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物苯丙烷衍生物,如类黄酮和木质素等,生物合成途径的一种关键酶,在大多数维管植物中4CL基因以基因家族的形式出现.4CL基因家族成员在植物组织中存在差异表达,并参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成.从4CL酶的基因结构、基因家族组成与表达特性等方面详细论述了当前最新研究进展,这将有助于更好地理解植物4CL基因参与苯丙烷类衍生物途径的合成与代谢机制.