真核翻译起始因子4γ2调控N-乙酰氨基半乳糖转移酶1 mRNA对胃癌细胞恶性表型的影响

目的探讨真核翻译起始因子4γ2(EIF4G2)通过调控N-乙酰氨基半乳糖转移酶1(GALNT1)mRNA对胃癌进展的影响。方法通过生物信息数据库分析GALNT1、EIF4G2在胃癌细胞和胃癌组织中的表达及与胃癌患者预后的关系,并分析胃癌组织中EIF4G2、GALNT1表达的相关性。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测GALNT1 mRNA、EIF4G2 mRNA在人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞(AGS细胞等)中的表达水平,并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测GALNT1、EIF4G2蛋白表达水平。建立干扰GALNT1和过表达EIF4G2的AGS细胞株,采用CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力,采用TUNEL实验检测细胞凋亡能力,采用划痕实验和Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭能力,采用Western blot检测凋亡和转移相关蛋白表达水平,采用RIP实验和RNA下拉实验检测GALNT1 mRNA与EIF4G2的结合关系。结果胃癌组织和胃癌细胞中的GALNT1、EIF4G2水平分别高于正常组织和人胃黏膜上皮细胞,差异有统计学意义(P<0.001),且与胃癌患者预后差相关;胃癌组织中,EIF4G2表达与GALNT1表达呈正相关。敲低GALNT1后,AGS细胞活力降低,克隆形成数、迁移和侵袭细胞数减少,凋亡细胞数增加,Bcl-2、MMP2、MMP9蛋白表达降低,Bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.001)。EIF4G2可与GALNT1 mRNA结合,促进GALNT1 mRNA、GALNT1蛋白表达及GALNT1 mRNA稳定性,差异有统计学意义(P<0.001)。共转染sh-GALNT1-1与oe-EIF4G2可逆转sh-GALNT1-1对AGS细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结论EIF4G2可通过稳定GALNT1 mRNA促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制细胞凋亡,其或可成为胃癌临床诊疗的新靶点。

版纳微型猪近交系免疫排斥相关基因B4GALNT2的克隆、表达及功能生物信息学分析

为探讨B4GALNT2基因在异种器官移植排斥反应中的作用,以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)为试验动物,研究BMI B4GALNT2基因的序列、结构和表达等特性。通过RT-PCR方法从扁桃体组织中获得B4GALNT2基因cDNA序列,先后应用qPCR和Western Blotting分别检测其mRNA及蛋白质在多种组织中的表达情况,并对蛋白质结构特征进行相关生物信息学分析。获得BMI B4GALNT2 CDS序列1 509 bp,编码502个氨基酸(GenBank核酸登录号:KU358546;蛋白质登录号:ANH21179.1),功能生物信息学分析显示该蛋白含有半乳糖转移酶结构域,有一个跨膜结构,无信号肽。荧光定量结果显示其mRNA在扁桃体、脾脏和淋巴结等重要免疫组织中相对高表达,Western Blotting结果同样显示BMI B4GALNT2蛋白在扁桃体等免疫组织中相对高表达。明确了B4GALNT2基因在BMI多组织中的表达情况,以及B4GALNT2蛋白质的基本结构和功能特征,为进一步深入探究B4GALNT2基因在猪-人异种移植免疫排斥方面的分子机制奠定基础。

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。

喉癌治疗后复发的影响因素分析及预测模型构建

目的分析喉癌(LC)治疗后复发的影响因素,并构建LC治疗后复发的预测模型。方法接受手术切除、放化疗或靶向治疗等治疗方案的LC患者80例,按照随访期内复发情况分为复发组17例、未复发组63例。收集患者的年龄、性别、体质量指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、LC家族史、基础疾病、肿瘤分期、肿瘤位置、肿瘤病理分型、肿瘤直径、肿瘤浸润深度、治疗方案等基本资料,采用qRT-PCR法检测血清细胞骨架蛋白4(CKAP4)、N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)、跨膜蛋白2(TMEM2)mRNA。采用COX回归分析法分析LC患者治疗后复发的影响因素,采用Logistic回归分析法构建LC治疗后复发的预测模型,采用受试者工作特征曲线(ROC)评估预测模型对LC治疗后复发的预测价值。结果复发组患者肿瘤分期Ⅲ~Ⅳ期占比、血清CKAP4 mRNA相对表达量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA相对表达量、血清TMEM2 mRNA相对表达量均显著高于未复发组(P均<0.05)。血清CKAP4 mRNA相对表达量、血清pp-GalNAc-T2 mRNA相对表达量、血清TMEM2 mRNA相对表达量是LC患者治疗后复发的影响因素(P均<0.05)。构建了LC治疗后复发的预测模型,预测概率=-8.967+0.724×血清CKAP4 mRNA相对表达量+0.081×血清pp-GalNAc-T2 mRNA相对表达量+1.132×血清TMEM2 mRNA相对表达量。预测模型的ROC结果显示,该模型对于LC治疗后复发具有较好的预测价值(AUC=0.872,95%CI=0.779~0.962,Cut off值≥0.229,P<0.001),该模型预测LC治疗后复发的灵敏度为88.23%、特异度为79.36%、阴性预测值为96.13%、阳性预测值为53.57%。结论血清CKAP4mRNA相对表达量、血清pp-GalNAc-T2mRNA相对表达量、血清TMEM2 mRNA相对表达量是LC患者治疗后复发的影响因素,基于上述影响因素构建的预测模型对LC治疗后复发具有较高的预测价值。